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Previous issue date: 2015-04-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / The use of Escherichia coli cultures to obtain heterologous proteins poses as a successful application of biotechnology for the production of drugs and enzymes. However, the stress caused by the synthesis of the recombinant protein as well as by the culture conditions may trigger physiological responses on the cell and also cause changes in the cell morphology, impacting on the rheology of the culture broth. This study aimed to evaluate changes in cell morphology, on the rheology of the broth and the effect of different temperatures and inducers in the cellular responses during recombinant protein production by E. coli in batch cultures. Five medium cell density cultures were conducted with two clones of rE. coli, using defined medium containing glycerol as main carbon source and different inducers (IPTG and lactose), at two different temperatures (37°C and 27°C). All experiments were performed in 5 L bench bioreactor, equipped with a monitoring and control system. Samples were collected throughout the experiments and rheological parameters were measured using a concentric cylinder rheometer. The morphological characteristics of the microorganism were also examined by optical microscopy associated with image analysis. The concentrations of cellular suspension (optical density and dry cell weight) as well as of sugars and metabolites (HPLC), the plasmid retention (subculture on plates with and without antibiotic), the concentration of viable cells (colony forming units), the production of recombinant protein (densitometry), the concentration of soluble proteins (Bradford protein assay) and the presence of polysaccharide in the broth (phenol–sulfuric method) were also monitored. It was found that broths, initially behaving as Newtonian fluids, undergo a change in rheological behavior during the growth phase, exhibiting a Bingham fluid behavior. During the induction phase, the consistency index and the initial shear stress seemed to follow the changes in cell concentration or the stress caused by the protein synthesis, respectively. In addition, the intensity of the variation of both rheological parameters seemed to be dependent upon the used inducer. The morphology analysis showed that rheological properties could not be explained by changes in cell length. The correlation between the cell concentration (measured by dry-weight method) and the optical density when lactose was employed as inducer, due to galactose accumulation within the cells as a result of the inability of the bacteria to metabolize this carbon source. The presence of a small amount of PspA and genetic material in the culture broth was probably due to permeabilization and lysis of a small part of the population. Carbon recovery analysis was performed for all cultures, leading to values close do 100 % before induction, in all studied cases. After induction, a sharp decrease on the recovery was observed. However, by including the carbon present in the polysaccharide quantified in the cultivation broth, it was possible to recover all supplied carbon as biomass, CO2 and polysaccharide. Finally, the highest production of protein was obtained at 37°C when induced by IPTG, reaching 125 mgPspA/gMS. The results contribute to a deeper understanding of the heterologous proteins production by rE. coli and allow the definition of intensification strategies for protein production. / O uso de cultivos de Escherichia coli para obtenção de proteínas heterólogas tem se mostrado uma área de aplicação bem sucedida da biotecnologia para a produção de fármacos e enzimas. Contudo, o estresse provocado pela síntese da proteína recombinante e pelas condições de cultivo pode desencadear respostas fisiológicas na célula, assim como provocar mudanças na morfologia celular e na reologia do caldo de cultivo. O presente trabalho teve como objetivo principal avaliar as mudanças na morfologia celular, na reologia dos caldos e o efeito de diferentes temperaturas e indutores sobre as respostas celulares durante o processo de produção de proteínas recombinantes por rE. coli em cultivos em batelada. Foram acompanhados cinco cultivos de média densidade celular de dois clones de rE. coli, conduzidos em meio definido contendo glicerol como principal fonte de carbono e como indutores IPTG e lactose em duas temperaturas (37°C e 27°C). Todos os cultivos foram realizados em biorreator de bancada de 5 L dotado de sistema de monitoramento e controle. Durante esses cultivos, amostras foram coletadas e os parâmetros reológicos foram avaliados por meio de um reômetro de cilindros concêntricos. As características morfológicas do microrganismo foram também acompanhadas com auxílio de microscopia ótica associada a programa de análise de imagens digitalizadas. Foram ainda monitoradas a concentração celular da suspensão (por medida de densidade ótica e massa seca), a concentração de açúcares e ácidos orgânicos (por HPLC), a retenção plasmidial (repicagem em placas com e sem antibiótico), a concentração de células cultiváveis (por contagem de unidades formadoras de colônia), a produção de proteína recombinante (por densitometria), a concentração de proteína solúvel (pelo método de Bradford) e a presença de polissacarídeo no caldo (pelo método fenol sulfúrico). Verificou-se que os caldos, inicialmente newtonianos, passam por uma mudança de comportamento reológico durante a fase de crescimento, passando a se comportar como um fluido Binghamiano. Durante a fase de indução, o índice de consistência e a tensão de cisalhamento inicial tiveram respostas ligadas à concentração celular e ao estresse causado pela síntese de proteína, respectivamente, e a intensidade desta resposta dependeu do indutor usado. A análise do comprimento celular não permitiu associar as mudanças reológicas com mudanças significativas na morfologia da população durante o cultivo. Verificou-se alteração na correlação entre a concentração celular (medida pelo método da massa seca) e a densidade ótica quando lactose foi empregada como indutor, em função do acúmulo de galactose no interior das células devido à incapacidade da bactéria em metabolizar essa fonte de carbono resultante da hidrólise da lactose. Foi possível observar a presença uma pequena quantidade de PspA e de material genético no caldo de cultivo, provavelmente devido a permeabilização e lise de pequena parte da população. Contabilizou-se a recuperação do carbono para todos os experimentos, obtendo-se valores próximos de 100 % antes da indução em todos os casos. Após a indução foi verificada uma acentuada queda nessa recuperação. Porém, incluindo o carbono presente no polissacarídeo quantificado no caldo de cultivo, foi possível recuperar todo o carbono fornecido na forma de biomassa, CO2 e polissacarídeo. Por fim, a maior produção de proteína foi obtida a 37°C e induzida por IPTG, alcançando 125 mgPspA/gMS, em cultivo caracterizado pela curta duração da fase de indução (apenas 4 horas). Os resultados contribuem para ampliar a compreensão do processo de produção de proteínas heterólogas por rE. coli e permitem definir estratégias de intensificação da produção de proteína.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/7770 |
| Date | 30 April 2015 |
| Creators | Silva, Gabriel Gonçalves |
| Contributors | Zangirolami, Teresa Cristina, Silva, Adilson José da |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Câmpus São Carlos, Programa de Pós-graduação em Engenharia Química, UFSCar |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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