Doctorado en Ciencias mención Microbiología. / Acidithiobacillus thiooxidans es una bacteria que obtiene energía metabólica y
poder reductor a partir de la oxidación de compuestos reducidos de azufre. En estado
natural, esta bacteria se encuentra junto con otros microorganismos participantes del
consorcio de biolixiviación de sulfuros metálicos formando estructuras multicelulares
llamadas biopelículas sobre la superficie de sulfuros minerales. Las células están
embebidas en una matriz de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) las cuales se
componen principalmente de exopolisacáridos, proteínas y lípidos.
Se ha descrito que la solubilización de los minerales sulfurados metálicos está
mediada por estos EPS. Sin embargo, la composición de los EPS y su rol exacto en la
solubilización de sulfuros metálicos ha sido caracterizado solamente en la bacteria
oxidadora de hierro y azufre Acidithiobacillus ferrooxidans, aunque las demás especies
de Acidithiobacillus que son capaces de oxidar solamente compuestos reducidos del
azufre son fundamentales en estos procesos de lixiviación.
En base a estos antecedentes, nos propusimos caracterizar alguno de los EPS y los
mecanismos moleculares involucrados en la formación de biopelículas en la especie
modelo At. thiooxidans. En un trabajo previo, se identificó un gen putativo que codifica
para una proteína de unión a c-di-GMP PelD, la cual está caracterizada en Pseudomonas
aeruginosa formando parte de un complejo multiproteico de membrana involucrado en
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la biosíntesis del exopolisacárido Pel. Al analizar el contexto genético del gen pelD, se
identificó un putativo operón con una estructura similar al operón canónico identificado
en P. aeruginosa. El análisis comparativo entre los genomas disponibles de las bacterias
acidófilas que están presentes en los entornos minerales ácidos reveló que este operón
sólo está presente en los genomas de At. thiooxidans y At. caldus.
Ante este resultado, este trabajo se enfocó en comprender cuál sería la importancia
de este exopolisacárido en la formación de biopelículas de At. thiooxidans sobre la
superficie de azufre elemental. La medición de los niveles de transcrito mediante qPCR
mostró que los genes pelA, pelD y wcaG del putativo operón presentan un mayor de
expresión en células adheridas que en células planctónicas. El análisis de azúcares de
superficie mediante el uso de lectinas identificó la presencia de N-acetil-galactosamina y
N-acetil-glucosamina. Tratando de dilucidar algunas de las señales que regulan la
producción de Pel, se descubrió que la adición exógena de la molécula de Quorum
Sensing (QS) 3-oxo-C8 AHL incrementa la transcripción de los genes pelA y pelD.
Finalmente, se procedió a obtener una cepa mutante nula en el gen pelD mediante
recombinación homóloga. Luego de analizar el DNA de esta cepa, se realizaron análisis
de adherencia y formación de biopelículas sobre la superficie de azufre elemental
mediante microscopía electrónica y de epifluorescencia. La mutación ΔpelD afectó la
estructura de la biopelícula al reducir la presencia de N-acetil-galactosamina y N-acetilglucosamina
en la superficie, pero adicionalmente provocó un incremento en la
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producción de estructuras filamentosas que rodean a las células. Para resolver la
incógnita sobre la naturaleza de estas fibras, se realizaron análisis comparativos
preliminares de la expresión de proteínas extracelulares. El análisis del sobrenadante de
los cultivos y de las proteínas del EPS reveló un cambio en producción de proteínas
secretadas al medio.
En base a estos resultados es posible concluir que el exopolisacárido Pel producido
por la bacteria biominera At. thiooxidans juega un rol estructural en la formación de
biopelículas sobre la superficie de azufre elemental y que la regulación de su síntesis
involucra a las vías del QS y del c-di-GMP. / Acidithiobacillus thiooxidans is a bacterium that obtains metabolic energy and
reducing power from the oxidation of reduced sulfur compounds. In the natural state,
this bacterium is found along with other microorganisms that are members of the metal
sulfides bioleaching consortium forming multicellular structures called biofilms on the
surface of mineral sulfides. The cells are embedded in a matrix of extracellular
polymeric substances (EPS) which are composed mainly of exopolysaccharides, proteins
and lipids.
It has been described that the solubilization of the metal sulfide minerals is
mediated by these EPS. However, the composition of the EPS and their exact role in the
solubilization of metal sulfides has been characterized only in the iron and sulfur
oxidizer bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans, although the other Acidithiobacillus
species that are only capable of oxidizing reduced sulfur compounds are important in
these leaching processes.
Based on this background, we set out to characterize some of the EPS and the
molecular mechanisms involved in biofilm formation in the model species At.
thiooxidans. In a previous work it was identified a putative gene encoding a c-di-GMP
binding PelD protein, which is characterized as part of a multiprotein membrane
complex involved in Pel exopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa.
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When we were analyzing the genetic context of the pelD gene, a putative operon with a
structure similar to the canonical operon identified in P. aeruginosa was identified.
Comparative analysis between available genomes of acidophilic bacteria that are present
in acidic mineral environments revealed that this operon is only present in the genomes
of At. thiooxidans and At. caldus.
Given this result, this work focused on understanding the importance of this
exopolisaccharide in biofilm formation of At. thiooxidans on the surface of elemental
sulfur. Measurement of transcript levels by qPCR showed that pelA, pelD and wcaG
genes of the putative operon exhibit a greater expression in attached cells than in
planktonic cells. The analysis of surface sugars by the use of lectins identified the
presence of N-acetyl-galactosamine and N-acetyl-glucosamine. Trying to elucidate some
of the signals that regulates the production of Pel, it was discovered that the exogenous
addition of Quorum Sensing (QS) molecule of 3-oxo-C8 AHL increases the transcription
of pelA and pelD genes.
Finally, a pelD gene null mutant strain was obtained by homologous
recombination. After analyzing the DNA of this strain, adherence and biofilm formation
analysis were performed on the elemental sulfur surface by electronic and
epifluorescence microscopy. The ΔpelD mutation affected the structure of the biofilm by
reducing the presence of N-acetyl-galactosamine and N-acetyl glucosamine on the
surface, but additionally caused an increase in the production of fibrillar structures
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surrounding the cells. To solve the unknown about the nature of these fibers, preliminary
comparative analysis of extracelluar protein expression were performed. Analysis of the
culture supernatant and proteins from EPS revealed a change in production of secreted
proteins to the medium.
Based on these results it is possible to conclude that the Pel exopolisaccharide
produced by the biomining bacterium At. thiooxidans plays a structural role at biofilm
formation on the surface of elemental sulfur and that the regulation of its synthesis
involves QS and c-di-GMP pathways. / Proyectos regulares Fondecyt 1120295 y 1160702 y beca Conicyt
21120064 por aportar el financiamiento durante el desarrollo de la tesis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/150665 |
| Date | 03 1900 |
| Creators | Díaz Fuenzalida, Mauricio Javier |
| Contributors | Guiliani Guerin, Nicolás, Universidad de Chile. Facultad de Ciencias. Escuela de Posgrado |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
| Relation | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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