A cultura do cacaueiro (Theobroma cacao L.) na região sul da Bahia foi dizimada com a introdução do fungo Moniliophthora perniciosa. Novas fontes de resistência têm sido buscadas e alternativas são necessárias para assegurar a produção de cultivares considerando a variabilidade genética do patógeno. A descoberta de genes de resistência e de defesa presumíveis a partir de abordagens genômicas impõe a necessidade de estabelecimento de uma plataforma de análise funcional para comprovar a função dos genes identificados e/ou esclarecimento dos mecanismos envolvidos; isto requer o desenvolvimento de métodos de manipulação e/ou inserção de genes, permitindo a superexpressão ou silenciamento de genes de interesse. Os primeiros cacaueiros transgênicos só foram desenvolvidos a poucos anos, e a eficiência do processo ainda é limitada. Há grande influência genotípica na capacidade embriogênica, que reduz a eficiência de obtenção de transgênicos. Micro-Tom tem sido considerado um modelo para pesquisas em tomateiro, sendo uma cultivar miniatura, ciclo de vida curto, porte reduzido e de fácil transformação. MT pode ser usada no estudo da interação com o fungo M. perniciosa, visto a disponibilidade de isolados do biótipo-S que infectam o tomateiro, assim disponibilizando informações dos mecanismos de defesa do T. cacao a M. perniciosa em um menor tempo, suprindo alguns obstáculos encontrados nas características biológicas do cacaueiro. Considerando que durante a patogênese do cacaueiro, M. perniciosa é capaz de desencadear a morte celular programada no tecido infectado, foi analisada a hipótese de que a expressão de genes anti-apoptóticos diminuiria ou minimizaria os efeitos da infecção, permitindo uma menor susceptibilidade. Para tal, foi clonado o gene da proteína Bax-inhibitor-1, que atua como atenuador basal para a progressão da morte celular, e desenvolvida uma construção. Esse gene havia sido detectado numa biblioteca da interação M. perniciosa x T. cacao e identificado com sequência completa, e foi re-introduzido em tomateiro e cacaueiro sob controle de promotor constitutivo. Para o modelo genético MT, plantas transgênicas contendo Bax-inhibitor-1, SKP1 e Cafeína sintase foram obtidas. Plantas transgênicas de tomateiro contendo o gene Bax-inhibitor-1 foram inoculadas com M. perniciosa e demonstraram redução no número de plantas sintomáticas (40%), quando comparadas as plantas de MT inoculadas com o mesmo patógeno (83%). Esses dados corroboram com resultados das inoculações com os fungos necrotróficos B. cinerea, S. sclerotium e S. rolfsii, sendo que as plantas transgênicas inoculadas também apresentaram contenção dos sintomas dessas doenças, uma redução de 40% da área de infecção em comparação as plantas de MT infectadas. Desse modo, pode-se concluir que o gene Bax-inhibitor-1 em MT agiu de forma basal na atenuação da progressão da morte celular, reduzindo os sintomas da vassoura-de-bruxa, da mesma forma que esse transgene contribuiu na redução dos sintomas do mofo cinza, mofo branco e murcha-de-esclerócio, por conter o crescimento e desenvolvimento dos fungos inoculados em tomateiro. Foi possível otimizar o protocolo de embriogênese somática e de transformação genética de cacaueiro, o que levou a obtenção de plantas transgênicas contendo a construção Bax-inhibitor-1, confirmadas por RTqPCR. Indicando que a abordagem de transformação de cacaueiro está implementada no laboratório, porém a baixa eficiência do processo e o tempo necessário ainda impedem seu uso em larga escala para análise funcional / The cultivation of cocoa (Theobroma cacao L.) in south Bahia was decimated by the introduction of the fungus Moniliophthora perniciosa. New sources of resistance have been sought and alternatives are needed to ensure the production of cultivars considering the genetic variability of the pathogen. The discovery of genes for resistance and defense presumed from genomic approaches makes it necessary the establishment of a platform to verify the function of identified genes and/or the elucidation of the mechanisms involved; this requires the development of methods for manipulating and/or insertion of genes, allowing overexpressing or silencing of genes of interest. The first transgenic cocoa were only developed a few years ago, and the efficiency of the process is still limited. There is an expressive influence of the embryogenic capacity, which reduces the efficiency of obtaining transgenic plants. The cultivar Micro-Tom (MT) is considered a model for research on tomato, since it has a miniature size, short life cycle, and facile genetic transformation. MT can be used to study the interaction with the fungus M. perniciosa, since isolates of biotype-S are able to infect tomato, thus provinding inferences about defense mechanisms of T. cacao to M. perniciosa in a short time, providing some obstacles encountered in biological characteristics of cocoa. Since during the pathogenesis of cocoa, M. perniciosa is able to trigger programmed cell death in infected tissue, it was analyzed the hypothesis that the expression of anti-apoptotic genes diminish or minimize the effects of infection, allowing less susceptibility. To this end, was cloned the protein Bax-inhibitor-1, which acts as a basal attenuator for the progression of cell death, was cloned engineered in a vector for genetic transformation. This gene was detected in a library of interaction M. perniciosa x T. cacao and identified with the complete sequence, and was re-introduced into tomato and cocoa under the control of a constitutive promoter. For the genetic model MT, transgenic plants containing Bax-inhibitor-1, SKP1 and Caffeine synthase were obtained. Transgenic tomato plants containing the gene Bax-inhibitor-1 were inoculated with M. perniciosa and demonstrated a reduction in the number of symptomatic plants (40%) compared MT plants inoculated with the same pathogen (83%). These data corroborate results of inoculations with the necrotroph fungi B. cinerea, S. sclerotium e S. rolfsii. Thus, when transgenic plants were inoculated, it was observed a reduction of 40% in the area of infection, compared to infected MT plants. Taken together, the results indicate that the gene Bax-inhibitor-1 acted in the basal attenuation of progression of cell death in MT, reducing the symptoms of the witches\' broom disease, as well as the symptoms of gray mold, white mold and wilt esclerotia. Moreover it was possible to optimize the protocol for somatic embryogenesis and genetic transformation of cocoa, which led to the production of transgenic plants containing the construct Baxinhibitor- 1, confirmed by RT-qPCR. Although, a protocol for cocoa transformation was implemented in the laboratory, its the low efficiency and the time required still prevent its widespread use for functional analysis
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-17042014-090316 |
| Date | 21 September 2012 |
| Creators | Scotton, Danielle Camargo |
| Contributors | Peres, Lazaro Eustaquio Pereira |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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