Orientador : Dr. Carlos Ricardo Soccol / Co-orientador : Dra. Juliana Degenhardt-Goldbach / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 23/02/2016 / Inclui referências : f.43-48;70-75;98-103 / Área de concentração: Saúde humana e animal / Resumo: Este trabalho teve por objetivos desenvolver um protocolo de regeneração por organogênese indireta e um protocolo de transformação genética para o clone BRS07-01 de E. urophylla, além de identificar e caraterizar uma bactéria endofítica isolada deste clone e avaliar sua interação com a Agrobacterium tumefaciens. Com relação a organogênese, a melhor taxa de regeneração (85.6%) foi observada quando os explantes foram primeiramente cultivados em meio de indução de calos WPM suplementado com 0.5 ?M de TDZ e 0.5 ?M de ANA e em seguida transferidos para o meio de indução de brotos com 5.0 ?M de BAP e 1.0 ?M de ANA. Após a regeneração dos brotos, a melhor taxa de enraizamento (84.0%) foi obtida em meio suplementado com 14.7 ?M de IBA. Com base na avaliação de 56 marcadores RAPD não foi observada variação somaclonal durante as fases da organogênese. Dois agentes seletivos foram testados para aumentar a eficiência de seleção, canamicina e geneticina, e a concentração mínima de 50 mgL-1 de canamicina foi selecionada para a transformação genética. Para o desenvolvimento de protocolo de transformação genética, vários fatores foram avaliados como dias de pré e co-cultivo, presença de Acetosyringona (AS), concentrações de agentes seletivos, tipo de explantes e tempo de sonificação. Quando usado o explante foliar, a maior eficiência de transformação genética (TE) foi de 2.67%, utilizando 50 ?M de AS no co-cultivo líquido e 100 ?M de AS no co-cultivo sólido. Entretanto, a maior TE de 20.83% foi observada com brotações como explantes submetidos a 2 min de sonificação e co-cultivados com 100 ?M de AS e selecionados em meio com 150 mgL-1 de Canamicina. Durante os experimentos, observamos a presença de bactérias endofíticas. Após isoladas, com base na análise filogenética, dois isolados foram identificados como Stenotrophomonas maltophilia, uma bactéria gramnegativa com sensibilidade a diferentes antibiótiocos, capaz de formar biofilme e sintetizar a auxina ácido indol-acético, que pode estar interferindo no processo e nos resultados de transformação genética. Palavras-chave: Agrobacterium tumefaciens, organogênese indireta, acetosseringona, GUS, nptII, Stenotrophomonas maltophilia / Abstract: This work aimed to develop an indirect organogenesis and a genetic transformation protocol for clone BRS07-01 of E. urophylla, as well as to isolate and characterize endophytic bacteria from this clone, which could be interfering in the Agrobacterium tumefaciens infection process during transformation of the clone. Regarding the organogenesis, the results showed that higher regeneration rate (85.6%) was observed when the leaves explants were first cultured on callus induction medium WPM supplemented with 0.5 ?M of TDZ and 0.5 ?M of NAA and then transferred to the shot induction medium with 5.0 ?M of BAP and 1.0 ?M NAA. The best adventitious root formation (80.0%) was observed when plantlets were cultured on medium supplemented with 14.7 ?M IBA. Based on 56 RAPD molecular markers we did not observe somaclonal variation during the organogenesis process. Two selective agents, kanamycin and geneticin, were tested to determine the best antibiotic and concentration for genetic transformation. Kanamycin at 50 mgL-1 showed to be the most effective. For genetic transformation, several factors were evaluated, as days on pre and co-culture, Acetosyringone (AS), concentrations of selective agents, explants type and sonication time. For leaf explants, higher transformation efficiency (TE) was 2.67% when the medium was supplemented with 50 ?M of AS on liquid co-culture and 100 ?M of AS on solid co-culture. However, the highest TE (20.83%) was observed when with microshoots were used as explants and they were submitted to 2 min of sonication, co-cultured with 100 ?M of AS and selected on medium with 150 mgL-1 of Kanamycin. Two isolates endophytic bacteria could be isolated and characterized as Stenotrophomonas maltophilia. This gramnegative bacteria, showed sensibility to different antibiotics and was able to form biofilm and synthetize the auxin indolacetic acid. For these reasons, we suggest that this endophytic can somehow be interfering in the genetic transformation of the BRS07-01 clone. Index terms: Agrobacterium tumefaciens, indirect organogenesis, Acetosyringone, GUS, nptII, Stenotrophomonas maltophilia
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:dspace.c3sl.ufpr.br:1884/43353 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Bettencourt, Gisela Manuela de França |
| Contributors | Goldbach, Juliana Degenhardt, Universidade Federal do Paraná. Setor de Tecnologia. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, Soccol, Carlos Ricardo, 1953- |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 105 f. : il. algumas color., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPR, instname:Universidade Federal do Paraná, instacron:UFPR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | Disponível em formato digital |
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