Orientador : Dr. Carlos Ricardo Soccol / Co-orientador : Dra. Juliana Degenhardt-Goldbach / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 23/02/2016 / Inclui referências : f.43-48;70-75;98-103 / Área de concentração: Saúde humana e animal / Resumo: Este trabalho teve por objetivos desenvolver um protocolo de regeneração por organogênese indireta e um protocolo de transformação genética para o clone BRS07-01 de E. urophylla, além de identificar e caraterizar uma bactéria endofítica isolada deste clone e avaliar sua interação com a Agrobacterium tumefaciens. Com relação a organogênese, a melhor taxa de regeneração (85.6%) foi observada quando os explantes foram primeiramente cultivados em meio de indução de calos WPM suplementado com 0.5 ?M de TDZ e 0.5 ?M de ANA e em seguida transferidos para o meio de indução de brotos com 5.0 ?M de BAP e 1.0 ?M de ANA. Após a regeneração dos brotos, a melhor taxa de enraizamento (84.0%) foi obtida em meio suplementado com 14.7 ?M de IBA. Com base na avaliação de 56 marcadores RAPD não foi observada variação somaclonal durante as fases da organogênese. Dois agentes seletivos foram testados para aumentar a eficiência de seleção, canamicina e geneticina, e a concentração mínima de 50 mgL-1 de canamicina foi selecionada para a transformação genética. Para o desenvolvimento de protocolo de transformação genética, vários fatores foram avaliados como dias de pré e co-cultivo, presença de Acetosyringona (AS), concentrações de agentes seletivos, tipo de explantes e tempo de sonificação. Quando usado o explante foliar, a maior eficiência de transformação genética (TE) foi de 2.67%, utilizando 50 ?M de AS no co-cultivo líquido e 100 ?M de AS no co-cultivo sólido. Entretanto, a maior TE de 20.83% foi observada com brotações como explantes submetidos a 2 min de sonificação e co-cultivados com 100 ?M de AS e selecionados em meio com 150 mgL-1 de Canamicina. Durante os experimentos, observamos a presença de bactérias endofíticas. Após isoladas, com base na análise filogenética, dois isolados foram identificados como Stenotrophomonas maltophilia, uma bactéria gramnegativa com sensibilidade a diferentes antibiótiocos, capaz de formar biofilme e sintetizar a auxina ácido indol-acético, que pode estar interferindo no processo e nos resultados de transformação genética. Palavras-chave: Agrobacterium tumefaciens, organogênese indireta, acetosseringona, GUS, nptII, Stenotrophomonas maltophilia / Abstract: This work aimed to develop an indirect organogenesis and a genetic transformation protocol for clone BRS07-01 of E. urophylla, as well as to isolate and characterize endophytic bacteria from this clone, which could be interfering in the Agrobacterium tumefaciens infection process during transformation of the clone. Regarding the organogenesis, the results showed that higher regeneration rate (85.6%) was observed when the leaves explants were first cultured on callus induction medium WPM supplemented with 0.5 ?M of TDZ and 0.5 ?M of NAA and then transferred to the shot induction medium with 5.0 ?M of BAP and 1.0 ?M NAA. The best adventitious root formation (80.0%) was observed when plantlets were cultured on medium supplemented with 14.7 ?M IBA. Based on 56 RAPD molecular markers we did not observe somaclonal variation during the organogenesis process. Two selective agents, kanamycin and geneticin, were tested to determine the best antibiotic and concentration for genetic transformation. Kanamycin at 50 mgL-1 showed to be the most effective. For genetic transformation, several factors were evaluated, as days on pre and co-culture, Acetosyringone (AS), concentrations of selective agents, explants type and sonication time. For leaf explants, higher transformation efficiency (TE) was 2.67% when the medium was supplemented with 50 ?M of AS on liquid co-culture and 100 ?M of AS on solid co-culture. However, the highest TE (20.83%) was observed when with microshoots were used as explants and they were submitted to 2 min of sonication, co-cultured with 100 ?M of AS and selected on medium with 150 mgL-1 of Kanamycin. Two isolates endophytic bacteria could be isolated and characterized as Stenotrophomonas maltophilia. This gramnegative bacteria, showed sensibility to different antibiotics and was able to form biofilm and synthetize the auxin indolacetic acid. For these reasons, we suggest that this endophytic can somehow be interfering in the genetic transformation of the BRS07-01 clone. Index terms: Agrobacterium tumefaciens, indirect organogenesis, Acetosyringone, GUS, nptII, Stenotrophomonas maltophilia

Orientador: Renato Wendhausen Júnior. / Dissertação (mestrado) - Universidade Regional de Blumenau, Centro de Ciências Exatas e Naturais, Programa de Pós-Graduação em Química.

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:52:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-04-24Bitstream added on 2015-05-14T16:59:44Z : No. of bitstreams: 1 000828601.pdf: 2257163 bytes, checksum: 0339aef0ed41dca2009f6cdc4a972bc0 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O interesse por micro-organismos, em especial os fungos derivados de ambientes poucos explorados como a Antártica, tem crescido nas últimas décadas. Os ecossistemas da Antártica por serem caracterizados por extremos de temperatura, salinidade ou valores de pH, inviabilizam o desenvolvimento de muitas formas de vida, sendo os micro-organismos os mais adaptados para se proliferar nos substratos deste continente. Os micro-organismos que se desenvolvem nos ecossistemas Antárticos são capazes de produzir enzimas adaptadas ao frio, as quais possuem potencial aplicação em diversos setores de importância econômica. O presente projeto é parte do Projeto Fapesp 2010/17033-0 intitulado “Exploração biotecnológica de fungos derivados da Antártica” coordenado pela Profa. Dra. Lara Sette e teve como objetivo conhecer a biodiversidade, selecionar fungos filamentosos com potencial ligninocelulolítico e avaliar a produção dessas enzimas a médias e baixas temperaturas. Para tanto, foram utilizados 160 isolados recuperados de amostras marinhas e terrestres do continente Antártico que se encontram mantidos na coleção de pesquisa da DRM (CPQBA/UNICAMP) e na Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRM-UNESP). Após a triagem inicial (em meio sólido e em meio líquido) dois fungos ligninolíticos foram selecionados para os experimentos subsequentes, um de origem marinha (P1) e outro de origem terrestre (M7), os quais foram identificados como Cadophora luteo-olivacea e Cadophora malorum, respectivamente. Os ensaios referentes à avaliação de diferentes fatores na produção de ligninases permitiu identificar os efeitos de cada uma das variáveis na atividade enzimática. Entretanto, a otimização da produção de lacase para o fungo C. luteo-olivacea P1 não foi eficiente, tendo em vista a baixa atividade desta enzima nas condições estudadas. Em substratos lignocelulósicos o fungo C. malorum M7 se destacou frente à atividade de... / The interest in microorganisms, especially fungi derived from underexplored environments such as Antarctica has increased in recent decades. Antarctica ecosystems have characteristics of extreme temperature, salinity or pH which prevents the development of many forms of life, being the micro-organisms the best adapted to proliferate in substrates of this continent. Microorganisms that grow in Antarctic ecosystems are able to produce cold adapted enzymes, which have potential application in many sectors of economic importance. This project is associated with the FAPESP Project 2010/17033-0 entitled “Biotechnological Exploitation of fungi derived from Antarctica, coordinated by Prof. Dr. Lara Sette and aims to know the biodiversity, to select filamentous fungi with lignocellulolytic potential and to evaluate the production of these enzymes at low and medium temperatures. For this purpose, we used 160 isolates recovered from marine and terrestrial samples of the Antarctic continent that have been maintained in the research collection of DRM (CPQBA/UNICAMP) and in the Microbial Resource Center of UNESP (CRM-UNESP). After the first screening (on solid medium and in liquid medium), two fungi were selected for subsequent experiments, one from marine sample (P1) and another one from terrestrial sample (M7), which were identified as Cadophora luteo-olivacea and Cadophora malorum, respectively. The assays regarding the evaluation of different factors in the production of ligninases allowed the identification of the effects of each variable on the enzyme activity. However, the optimization of laccase production by Cadophora luteo olivacea P1 was not efficient because the low activity of this enzyme under the conditions studied. In lignocellulosic substrates the fungus C. malorum M7 presents the best xylanase activity when grown on sugarcane bagasse and corn cobs. Among the 160 filamentous fungi studied, 76 were taxonomically characterized...

Orientador: Lara Durães Sette / Coorientador: André Rodrigues / Banca: Eleonora Cano Carmona / Banca: Rafaella Costa Bonugli Santos / Resumo: O interesse por micro-organismos, em especial os fungos derivados de ambientes poucos explorados como a Antártica, tem crescido nas últimas décadas. Os ecossistemas da Antártica por serem caracterizados por extremos de temperatura, salinidade ou valores de pH, inviabilizam o desenvolvimento de muitas formas de vida, sendo os micro-organismos os mais adaptados para se proliferar nos substratos deste continente. Os micro-organismos que se desenvolvem nos ecossistemas Antárticos são capazes de produzir enzimas adaptadas ao frio, as quais possuem potencial aplicação em diversos setores de importância econômica. O presente projeto é parte do Projeto Fapesp 2010/17033-0 intitulado "Exploração biotecnológica de fungos derivados da Antártica" coordenado pela Profa. Dra. Lara Sette e teve como objetivo conhecer a biodiversidade, selecionar fungos filamentosos com potencial ligninocelulolítico e avaliar a produção dessas enzimas a médias e baixas temperaturas. Para tanto, foram utilizados 160 isolados recuperados de amostras marinhas e terrestres do continente Antártico que se encontram mantidos na coleção de pesquisa da DRM (CPQBA/UNICAMP) e na Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRM-UNESP). Após a triagem inicial (em meio sólido e em meio líquido) dois fungos ligninolíticos foram selecionados para os experimentos subsequentes, um de origem marinha (P1) e outro de origem terrestre (M7), os quais foram identificados como Cadophora luteo-olivacea e Cadophora malorum, respectivamente. Os ensaios referentes à avaliação de diferentes fatores na produção de ligninases permitiu identificar os efeitos de cada uma das variáveis na atividade enzimática. Entretanto, a otimização da produção de lacase para o fungo C. luteo-olivacea P1 não foi eficiente, tendo em vista a baixa atividade desta enzima nas condições estudadas. Em substratos lignocelulósicos o fungo C. malorum M7 se destacou frente à atividade de... / Abstract: The interest in microorganisms, especially fungi derived from underexplored environments such as Antarctica has increased in recent decades. Antarctica ecosystems have characteristics of extreme temperature, salinity or pH which prevents the development of many forms of life, being the micro-organisms the best adapted to proliferate in substrates of this continent. Microorganisms that grow in Antarctic ecosystems are able to produce cold adapted enzymes, which have potential application in many sectors of economic importance. This project is associated with the FAPESP Project 2010/17033-0 entitled "Biotechnological Exploitation of fungi derived from Antarctica", coordinated by Prof. Dr. Lara Sette and aims to know the biodiversity, to select filamentous fungi with lignocellulolytic potential and to evaluate the production of these enzymes at low and medium temperatures. For this purpose, we used 160 isolates recovered from marine and terrestrial samples of the Antarctic continent that have been maintained in the research collection of DRM (CPQBA/UNICAMP) and in the Microbial Resource Center of UNESP (CRM-UNESP). After the first screening (on solid medium and in liquid medium), two fungi were selected for subsequent experiments, one from marine sample (P1) and another one from terrestrial sample (M7), which were identified as Cadophora luteo-olivacea and Cadophora malorum, respectively. The assays regarding the evaluation of different factors in the production of ligninases allowed the identification of the effects of each variable on the enzyme activity. However, the optimization of laccase production by Cadophora luteo olivacea P1 was not efficient because the low activity of this enzyme under the conditions studied. In lignocellulosic substrates the fungus C. malorum M7 presents the best xylanase activity when grown on sugarcane bagasse and corn cobs. Among the 160 filamentous fungi studied, 76 were taxonomically characterized... / Mestre

Orientador: Fabio Marcio Squina, Roberto Ruller / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T02:46:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hoffmam_ZairaBruna_M.pdf: 4922807 bytes, checksum: df6edae9e54a10424f07783fcf889151 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O etanol de segunda geração, produzido a partir dos polissacarídeos da biomassa lignocelulósica, apresenta-se como uma alternativa promissora para tornar a matriz energética brasileira sólida e, em grande parte, renovável. A biomassa é composta basicamente por celulose, hemicelulose e lignina. Celulose e hemicelulose devem ser hidrolisadas a açúcares monoméricos fermentescíveis para produzir etanol. Entretanto, a tarefa de propor um processo enzimático de hidrólise eficiente e de baixo custo com a finalidade de sacarificar a biomassa é desafiadora, pois os polissacarídeos que a compõem são complexos e recalcitrantes. Embora as hemiceluloses representem cerca de 30% dos açúcares do bagaço da cana-de-açúcar, uma das biomassas mais promissoras para a produção de etanol de segunda geração no Brasil, ainda poucos estudos são direcionados ao estudo da sacarificação dessa fração de polissacarídeos. Hemicelulases são glicosídeo hidrolases que catalisam a hidrólise dos polissacarídeos hemicelulósicos, e que em atuação sinérgica com celulases promove a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar de maneira mais eficiente que as classes de enzimas isoladamente. A primeira parte dessa dissertação apresenta a caracterização bioquímica e biofísica de uma arabinofuranosidase GH51 do micro-organismo Bacillus subtilis 168. ?-L-arabinofuranosidases são hemicelulases que hidrolisam terminais não redutores de polissacarídeos contendo arabinose. A AbfA mostrou-se robusta, atuando numa ampla faixa de temperatura, e capaz de liberar monômeros de arabinose hidrolisando 1,5-?-L-arabinoheptaose a partir da extremidade não-redutora. A análise dos dados de SAXS combinada com simulações de dinâmica molecular mostrou que a AbfA em solução é hexamérica, com cada subunidade contendo uma molécula com domínio catalítico em enovelado na forma de barril (?/?)8 seguido por um domínio acessório ?-sandwich. Esses dados evidenciam que a estrutura quaternária pode ser importante para o desempenho de atividade das arabinofuranosidases da família 51. A segunda parte da dissertação aborda uma avaliação da influência dos domínios de ligação a carboidratos na atividade de xilanases mesofílicas e termofílicas. Xilanases são hemicelulases que catalisam a hidrólise de ligações endo-1,4-?-D-xilosídicas na molécula de xilano. Fusões gênicas uniram end-to-end um CBM6 de Clostridium thermocellum aos domínios catatalíticos xilanásicos das enzimas GH10 termofílica (de Thermotoga petrophila) e GH11 mesofílica (de Bacillus subtilis 168). O CBM6 alterou o padrão de hidrólise das quimeras termofílicas e aumentou a constante de eficiência da quimera mesofílica, quando comparadas as enzimas nativas respectivas. Além disso, na hidrólise da biomassa da cana-de-açúcar a xilanase quimérica mesofílica suplementou o coquetel comercial Accellerase 1500, liberando mais açúcares redutores. Dessa forma a fusão ao CBM6 mostrou-se uma alternativa para construir enzimas com melhor desempenho cinético / Abstract: The second generation ethanol, produced from lignocellulosic biomass polysaccharides, presents itself as a promising alternative to make the Brazilian energy matrix solid and largely renewable. Biomass is composed mainly of cellulose, hemicellulose and lignin. Cellulose and hemicellulose must be hydrolyzed in fermentable monomeric sugars to produce ethanol. However, the task of proposing a process for enzymatic hydrolysis efficient and low cost in order to saccharify the biomass is challenging because its polysaccharides are complex and recalcitrant, so it requires the presence of several different catalytic activities for hydrolysis. Although hemicelluloses represent about 30% of sugars from sugarcane bagasse, one of the most promising biomass for the production of second generation ethanol in Brazil, few studies are directed to the saccharification study of this polysaccharidic fraction. Hemicellulases are glycoside hydrolases that catalyze the hydrolysis of hemicellulosic polysaccharides and works synergistically with cellulases promoting the hydrolysis of sugarcane bagasse more efficiently than each one class of enzymes alone. The first part of this dissertation presents the biochemistry and biophysics characterization of a GH51 arabinofuranosidase from microorganism Bacillus subtilis 168. ?-Larabinofuranosidases are hemicellulases that hydrolyze linkages in terminal nonreducing ends of polysaccharides containing arabinose. The AbfA showed itself robust, working in a wide temperature range, and able to release arabinose monomers hydrolyzing 1,5-?-L-arabinoheptaose from the non-reducing end. The analysis of SAXS data in combination with molecular dynamics simulations showed that AbfA solution is hexameric, with each subunit containing a molecule with catalytic domain coiled in the form of barrel (?/?)8 followed by a ?-sandwich domain accessory. These results evidence and corroborate data that the quaternary structure may be important for the activity of GH51 arabinofuranosidases family. The second part of the thesis adresses an evaluation of the influence of carbohydratebinding modules, non-catalytic domains of polysaccharides recognition, in the activity of mesophilic and thermophilic xylanases. Xylanases are hemicellulases that catalyze the hydrolysis of endo-1 ,4-?-D-xylosidic linkages in xylan molecule. Gene fusions joined end-to-end a CBM6 from Clostridium thermocellum to catalytic xylanasic domains of enzymes thermophilic GH10 (from Thermotoga petrophila) and mesophilic GH11 (from Bacillus subtilis 168). The CBM6 changed the hydrolysis pattern of thermophilic chimeras increased the efficiency constant of mesophilic chimera, when compared to the respective native enzymes. Furthermore, in the sugarcane biomass hydrolysis mesophilic chimeric xylanase supplemented the commercial cocktail Accellerase 1500, releasing more reducing sugars. In conclusion, the CBM6 fusion proved itself an alternative to construct enzymes with better kinetic performance / Mestrado / Bioquimica / Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Mário Tyago Murakami / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T21:09:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paiva_JoiceHelena_D.pdf: 28922115 bytes, checksum: be729b855c60f1b34aac3a0b43e0aeac (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular