Orientador: Fabio Marcio Squina / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T12:41:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alvarez_ThabataMaria_D.pdf: 22982311 bytes, checksum: 1bc2a260df2bfab4948ffb299f13a63f (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Devido à necessidade do desenvolvimento de fontes de energias renováveis é de grande interesse a descoberta de novas enzimas envolvidas na desconstrução da parede celular vegetal para a produção de bicombustíveis. A metagenômica é uma poderosa ferramenta para a descoberta de novos genes em comunidades microbianas que não são passíveis de cultivo pelas técnicas tradicionais. Neste contexto, o objetivo desta tese foi o desenvolvimento de estratégias metagenômicas para prospecção de novas enzimas atuantes na degradação da biomassa vegetal no metagenoma de solo de canavial bem como a caracterização funcional das mesmas. A biblioteca metagenômica construída com DNA extraído de um consórcio microbiano especializado na degradação de bagaço de cana-de-açúcar explodido a vapor e deslignificado foi empregada nos experimentos de triagem funcional de alto desempenho. Como resultado, foram identificados três clones positivos com atividade celulolítica e dois clones com atividade xilanolítica. A análise dos insertos de cada um dos clones resultou na localização de ORFs cujas sequências de aminoácidos apresentaram identidade com domínios conservados de glicosil hidrolases da família 5 (celulases E-1 e E-2), família 6 (celulase E-3), família 10 (xilanase X-1) e família 16 (glicosil hidrolase X-2). A celulase E-1 apresentou em sua estrutura além do domínio catalítico, E-1 Cat, um domínio de ligação a carboidratos, denominado E-1 CBM, que não apresentou identidade de sequência com domínios conservados conhecidos. A análise funcional do E-1 CBM revelou tratar-se de um CBM específico para cadeias de glucano com grau de polimerização mínimo de cinco unidades de glicose. Ensaios de atividade enzimática em diferentes substratos mostraram que E-1 Cat atuou especificamente na hidrólise das ligações glicosídicas do tipo ß(1,4) entre resíduos de glicose. Os maiores valores de atividade enzimática foram obtidos em pH 7,0 e temperatura de 50ºC. Os parâmetros cinéticos calculados em CMC foram Km igual a 6,05 ± 0,37 mg/mL, Vmax de 42,51 ± 1,2 ?mol/min/mg e eficiência catalítica kcat/Km de 4,06 mL/mg/s. A enzima apresentou termoestabilidade a 40ºC por cinco horas. A atividade enzimática de E-1 Cat em celulose cristalina e bagaço de cana-de-açúcar explodido a vapor resultou na liberação de açúcares solúveis, evidenciando sua potencial aplicação em processos de conversão da biomassa vegetal. Ensaios de atividade em diferentes substratos mostraram que X-1 apresentou maior atividade enzimática em xilana não ramificada, nas condições de pH e temperatura de 6,0 e 45ºC, respectivamente. Os parâmetros cinéticos calculados utilizando como substrato xilana de madeira de faia foram Km de 2,18 ± 0,13 mg/mL, Vmax de 1.435 ± 30,4 ?mol/min/mg e kcat/Km de 496,32 mL/mg/s. Em relação à termoestabilidade, a enzima se manteve estável a 40ºC e 50ºC por seis horas. A hidrólise de substratos complexos com X-1 resultou na liberação de xilooligossacarídeos, xilobiose e xilose, que são compostos que apresentam potencial aplicação nas indústrias alimentícias e de biocombustíveis. Os resultados obtidos neste estudo validaram a abordagem metagenômica desenvolvida para a descoberta de novos genes codificantes para glicosil hidrolases. Além disso, a estratégia descrita nesta tese pode ser estendida para a descoberta de uma miríade de bioprodutos de interesse biotecnológico / Abstract: Due to the necessity of development of renewable sources of energy, it is of great interest the discovery of novel enzymes involved in plant cell wall deconstruction for biofuels production. Metagenomics is a powerful tool for the discovery of novel genes in microbial communities that are not liable to cultivation by traditional techniques. In this context, the aim of this thesis was the development of metagenomic strategies for prospection of novel enzymes involved in plant biomass degradation in sugarcane field soil metagenome and functional characterization of the identified enzymes. The metagenomic library constructed with DNA extracted from a microbial consortium specialized in degradation of steam exploded delignified sugarcane bagasse was used in the experiments of high-performance functional screening. As a result, we identified three positive clones with cellulolytic activity and two clones with xylanolytic activity. The analysis of the inserts from each clone resulted in the location of ORFs whose amino acid sequences showed identity to conserved domains of glycoside hydrolase family 5 (cellulases E-1 and E-2), family 6 (cellulase E-3), family 10 (xylanase X-1) and family 16 (glycoside hydrolase X-2). Cellulase E-1 exhibited in addition to the catalytic domain, E-1 Cat, a carbohydrate binding module, called E-1 CBM, which showed no sequence identity with known conserved domains. Functional analysis of E-1 CBM showed that it is a CBM specific for glucan chains with a degree of polymerization of at least five units of glucose. Assays with a set of different substrates revealed that E-1 Cat hydrolyzed specifically ß(1,4) glycoside bonds between glucose residues. The highest value of enzymatic activity was obtained at pH 7.0 and temperature of 50°C. The kinetic parameters Km, Vmax and catalytic efficiency kcat/Km calculated using CMC were 6.05 ± 0.37 mg/mL, 42.51 ± 1.2 ?mol/min/mg and 4.06 mL/mg/s, respectively. The enzyme showed thermal stability at 40°C for five hours. The enzymatic activity of E-1 Cat in crystalline cellulose and steam exploded sugarcane bagasse resulted in the release of soluble sugars, demonstrating its potential application in processes of biomass conversion. The xylanase X-1 showed higher enzyme activity in debranched xylan, in reactions conducted in pH 6.0 and temperature of 45°C. The kinetic parameters Km, Vmax and catalytic efficiency kcat/Km calculated using beechwood xylan were 2.18 ± 0.13 mg/mL, 1,435 ± 30.4 ?mol/min/mg and 496.32 mL/mg/s, respectively. In relation to thermal stability, the enzyme was stable at 40°C and 50°C for six hours. The hydrolysis of complex substrates resulted in the release of xylo-oligosaccharides, xylobiose and xylose, which are compounds that have potential application in food and biofuels industries. The results of this study validated the metagenomic approach developed for the discovery of novel genes coding for glycoside hydrolases. Moreover, the strategy described in this work can be extended to the discovery of a myriad of byproducts of biotechnological interest / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Introdução: Durante a progressão da neoplasia maligna, as células tumorais desenvolvem a habilidade de invadir 0 tecido normal adjacente e de formar novos focos à distância. Recentemente, pesquisas tem destacado as alterações que ocorrem no ambiente entre a célula e a matriz extracelular durante 0 processo de expansão neoplásica. A enzima heparanase-1 possui a capacidade de degradar 0 heparam sulfato, um importante polissacarídeo que participa da estrutura da matriz extracelular e da membrana basal. Diversos artigos associam 0 aumento de sua expressão ao potencial invasor, angiogênico e metastático de diversos tumores malignos. A heparanase-2, provavelmente, esta relacionada com a perda da adesividade celular. Objetivo: Associar novos conhecimentos a respeito desta isoforma poderá ser útil para esclarecer as inúmeras mudanças que ocorrem nas neoplasias. Métodos: Analisamos 75 espécimes de ovários de pacientes atendidas no Departamento de Ginecologia da Unifesp-EPM. Selecionamos 23 (30,66%) pacientes com neoplasia ovariana epitelial maligna; destas, cinco tinham neoplasia restrita aos ovários - estádios IA e 1B (FIGO) e 17 tinham neoplasia nos estádios IC ou superior. Outras 35 mulheres (46,66%) apresentavam neoplasia ovariana epitelial benigna e as 17 (22,66%) restantes, tinham 0 diagnóstico histológico de ovário não neoplásico. Utilizamos duas técnicas metodológicas para avaliar a imunoexpressão da heparanase¬2. A primeira, obedecendo ao critério qualitativo de positivo ou negativo em relação a expressão da enzima e, a segunda, realizando, nas mesmas laminas, quantificação computadorizada desta expressão. Resultados: Na análise quantitativa, encontramos índice de positividade (IP) de expressão de heparanase-2 de 72,24% e 87,34% nas amostras de neoplasias benigna e maligna, respectivamente. Nelas, a intensidade de expressão e 0 índice de expressão foram de, respectivamente, 147,24 e 121,29 para as neoplasias benignas e de 134,15 e 118,01 para as neoplasias malignas. Qualitativamente, a expressão da heparanase-2 foi de intensidade forte ou moderada em 44,2% dos tumores benignos e 78,2% dos malignos. Todas as amostras não neoplásicas foram negativas para a expressão da enzima, com exceção de uma amostra em que a análise qualitativa foi fracamente positiva. Conclusões: Pudemos observar a importância desta enzima na expansão tumoral, devido a evidente diferença entre os grupos de neoplasias comparados com 0 grupo de amostras de tecido ovariano não neoplásico. Entretanto, não verificamos variação significativa entre as neoplasias quanta à presença e intensidade de reação imunohistoquímica entre a neoplasia benigna e maligna, nas duas técnicas de análise.. / Introduction: During the progression of malignant neoplasia, the tumor cells develop the ability to invade the adjacent normal tissue and form new foci at a distance. Recently, studies have highlighted the changes that take place in the environment between the cell and the extracellular matrix during the process of neoplastic expansion. The enzyme heparanase-1 has the capacity to degrade heparan sulfate, which is an important polysaccharide that participates in the structure of the extracellular matrix and the basal membrane. Several papers have made an association between increased expression of this enzyme and the invasive, angiogenic and metastatic potential of various malignant tumors. Heparanase-2 is probably related to loss of cell adhesion. Objective: Making associations with new knowledge on this isoform may be useful for explaining the large number of changes that occur in neoplasia. Methods: We analyzed 75 ovary specimens from patients attended at the Department of Gynecology of Unifesp-EPM. We selected 23 patients (30.66%) with malignant epithelial ovarian neoplasia. Of these, five had neoplasia that was restricted to the ovaries, in FIGO stages IA and IB, and 17 had neoplasia in stages IC or higher. Another 35 women (46.66%) presented benign epithelial ovarian neoplasia and the histological diagnosis for the remaining 17 (22.66%) was that their ovaries were not neoplastic. We used two methodological techniques for evaluating the immunoexpression of heparanase-2. The first followed the qualitative criterion of positive or negative in relation to expression of the enzyme, and the second involved computerized quantification of this expression, performed on the same slides. Results: In the quantitative analysis, we found positivity indices for heparanase-2 expression of 72.24% and 87.34% in the samples of benign and malignant neoplasias, respectively. In these, the intensity of expression and the express index were, respectively, 147.24 and 121.29 for the benign neoplasias and 134.15 and 118.01 for the malignant neoplasias. Qualitatively, the expression of heparanase-2 was strong or moderate in intensity in 44.2% of the benign tumors and 78.2% of the malignant tumors. All the nonneoplastic samples were negative for the expression of this enzyme, with the exception of one sample in which the qualitative analysis was weakly positive. Conclusions: We were able to observe the importance of this enzyme in tumor expansion because of the evident difference between the neoplastic groups and the non-neoplastic group of ovarian tissue samples. However, we did not find any significant variation among the neoplasias with regard to the presence and intensity of the immunohistochemical reaction, between benign and malignant neoplasia, for either of the analysis techniques. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A Doença de Gaucher (DG) é a doença lisossômica de depósito mais frequente, sendo causada pela deficiência da atividade da enzima β-glicosidase ácida (GBA), que é responsável pela degradação de glicosilceramidas nos lisossomos. Seu déficit resulta no acúmulo intracelular de glicosilceramidas formando as chamadas Células de Gaucher. A DG é dividida em três grupos baseada na ausência (tipo 1) ou presença e gravidade de envolvimento do sistema nervoso central (tipo 2 e 3). A demonstração da deficiência da atividade da GBA é considerada o método padrão ouro para o diagnóstico, sendo complementada pela medida da atividade da enzima quitotriosidase (QT), que é considerada um biomarcador para a DG. Embora a função exata das células de Gaucher ainda permaneça desconhecida, acredita-se que elas secretam fatores que induzem resposta inflamatória e a produção de espécies reativas. Sabe-se que a instituição do tratamento por reposição enzimática (TRE) diminui significativamente a atividade da QT, porém essa diminuição não chega até os níveis de normalidade. A deficiência da GBA na DG também induz uma cascata de eventos, culminando secundariamente na produção de espécies reativas. Visto isso, o objetivo deste trabalho foi mensurar os níveis de citocinas próinflamatórias (IL-6, TNF-α e IL-17a), proteína S100B em pacientes com DG com e sem tratamento por reposição enzimática e relacioná-los com a atividade da QT, e também, determinar o nível de alguns marcadores de dano oxidativo como substancias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), conteúdo de carbonilas, atividade da catalase (CAT) e superoxido dismutase (SOD) e mensurar o conteúdo total de sulfidrilas (SH), marcadores da defesa antioxidante, visando um método auxiliar para o diagnóstico e acompanhamento do tratamento destes pacientes. Observamos que os níveis de IL-6 em pacientes DG sem tratamento foi duas vezes maior do que os encontrados nos indivíduos saudáveis e que a instituição do TRE provoca uma diminuição significativa nos níveis de IL-6 no soro dos pacientes. Também foi observada uma correlação positiva entre os níveis de IL-6 e a atividade da QT, ou seja, quanto maior a atividade da QT, maior os níveis de IL-6 no soro de pacientes em tratamento. Já as outras citocinas pró-inflamatórias mensuradas, TNF-α e IL-17a, não apresentaram diferença significativa entre os indivíduos saudáveis e os pacientes Gaucher, bem como a medida da proteína S100B. Nos fatores oxidativos observamos alterações na CAT, SOD e sulfidrilas, o que sugere que pacientes DG sofrem mudanças na produção de espécies reativas quando comparados aos indivíduos normais. Este aumento na CAT, SOD e sulfidrilas poderia estar relacionado com a prevenção do aumento do peróxido de hidrogênio e a prevenção de danos lipídicos. No entanto, os outros três parâmetros (TBARS, carbonila e relação SOD / CAT) não demonstraram uma diferença significativa entre os grupos. Com isso, concluímos que a IL-6 mostrou-se a melhor ferramenta a ser utilizada juntamente com a QT para auxiliar no diagnóstico e acompanhamento do tratamento de pacientes DG.

A Doença de Gaucher (DG) é a doença lisossômica de depósito mais frequente, sendo causada pela deficiência da atividade da enzima β-glicosidase ácida (GBA), que é responsável pela degradação de glicosilceramidas nos lisossomos. Seu déficit resulta no acúmulo intracelular de glicosilceramidas formando as chamadas Células de Gaucher. A DG é dividida em três grupos baseada na ausência (tipo 1) ou presença e gravidade de envolvimento do sistema nervoso central (tipo 2 e 3). A demonstração da deficiência da atividade da GBA é considerada o método padrão ouro para o diagnóstico, sendo complementada pela medida da atividade da enzima quitotriosidase (QT), que é considerada um biomarcador para a DG. Embora a função exata das células de Gaucher ainda permaneça desconhecida, acredita-se que elas secretam fatores que induzem resposta inflamatória e a produção de espécies reativas. Sabe-se que a instituição do tratamento por reposição enzimática (TRE) diminui significativamente a atividade da QT, porém essa diminuição não chega até os níveis de normalidade. A deficiência da GBA na DG também induz uma cascata de eventos, culminando secundariamente na produção de espécies reativas. Visto isso, o objetivo deste trabalho foi mensurar os níveis de citocinas próinflamatórias (IL-6, TNF-α e IL-17a), proteína S100B em pacientes com DG com e sem tratamento por reposição enzimática e relacioná-los com a atividade da QT, e também, determinar o nível de alguns marcadores de dano oxidativo como substancias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), conteúdo de carbonilas, atividade da catalase (CAT) e superoxido dismutase (SOD) e mensurar o conteúdo total de sulfidrilas (SH), marcadores da defesa antioxidante, visando um método auxiliar para o diagnóstico e acompanhamento do tratamento destes pacientes. Observamos que os níveis de IL-6 em pacientes DG sem tratamento foi duas vezes maior do que os encontrados nos indivíduos saudáveis e que a instituição do TRE provoca uma diminuição significativa nos níveis de IL-6 no soro dos pacientes. Também foi observada uma correlação positiva entre os níveis de IL-6 e a atividade da QT, ou seja, quanto maior a atividade da QT, maior os níveis de IL-6 no soro de pacientes em tratamento. Já as outras citocinas pró-inflamatórias mensuradas, TNF-α e IL-17a, não apresentaram diferença significativa entre os indivíduos saudáveis e os pacientes Gaucher, bem como a medida da proteína S100B. Nos fatores oxidativos observamos alterações na CAT, SOD e sulfidrilas, o que sugere que pacientes DG sofrem mudanças na produção de espécies reativas quando comparados aos indivíduos normais. Este aumento na CAT, SOD e sulfidrilas poderia estar relacionado com a prevenção do aumento do peróxido de hidrogênio e a prevenção de danos lipídicos. No entanto, os outros três parâmetros (TBARS, carbonila e relação SOD / CAT) não demonstraram uma diferença significativa entre os grupos. Com isso, concluímos que a IL-6 mostrou-se a melhor ferramenta a ser utilizada juntamente com a QT para auxiliar no diagnóstico e acompanhamento do tratamento de pacientes DG.

A Doença de Gaucher (DG) é a doença lisossômica de depósito mais frequente, sendo causada pela deficiência da atividade da enzima β-glicosidase ácida (GBA), que é responsável pela degradação de glicosilceramidas nos lisossomos. Seu déficit resulta no acúmulo intracelular de glicosilceramidas formando as chamadas Células de Gaucher. A DG é dividida em três grupos baseada na ausência (tipo 1) ou presença e gravidade de envolvimento do sistema nervoso central (tipo 2 e 3). A demonstração da deficiência da atividade da GBA é considerada o método padrão ouro para o diagnóstico, sendo complementada pela medida da atividade da enzima quitotriosidase (QT), que é considerada um biomarcador para a DG. Embora a função exata das células de Gaucher ainda permaneça desconhecida, acredita-se que elas secretam fatores que induzem resposta inflamatória e a produção de espécies reativas. Sabe-se que a instituição do tratamento por reposição enzimática (TRE) diminui significativamente a atividade da QT, porém essa diminuição não chega até os níveis de normalidade. A deficiência da GBA na DG também induz uma cascata de eventos, culminando secundariamente na produção de espécies reativas. Visto isso, o objetivo deste trabalho foi mensurar os níveis de citocinas próinflamatórias (IL-6, TNF-α e IL-17a), proteína S100B em pacientes com DG com e sem tratamento por reposição enzimática e relacioná-los com a atividade da QT, e também, determinar o nível de alguns marcadores de dano oxidativo como substancias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), conteúdo de carbonilas, atividade da catalase (CAT) e superoxido dismutase (SOD) e mensurar o conteúdo total de sulfidrilas (SH), marcadores da defesa antioxidante, visando um método auxiliar para o diagnóstico e acompanhamento do tratamento destes pacientes. Observamos que os níveis de IL-6 em pacientes DG sem tratamento foi duas vezes maior do que os encontrados nos indivíduos saudáveis e que a instituição do TRE provoca uma diminuição significativa nos níveis de IL-6 no soro dos pacientes. Também foi observada uma correlação positiva entre os níveis de IL-6 e a atividade da QT, ou seja, quanto maior a atividade da QT, maior os níveis de IL-6 no soro de pacientes em tratamento. Já as outras citocinas pró-inflamatórias mensuradas, TNF-α e IL-17a, não apresentaram diferença significativa entre os indivíduos saudáveis e os pacientes Gaucher, bem como a medida da proteína S100B. Nos fatores oxidativos observamos alterações na CAT, SOD e sulfidrilas, o que sugere que pacientes DG sofrem mudanças na produção de espécies reativas quando comparados aos indivíduos normais. Este aumento na CAT, SOD e sulfidrilas poderia estar relacionado com a prevenção do aumento do peróxido de hidrogênio e a prevenção de danos lipídicos. No entanto, os outros três parâmetros (TBARS, carbonila e relação SOD / CAT) não demonstraram uma diferença significativa entre os grupos. Com isso, concluímos que a IL-6 mostrou-se a melhor ferramenta a ser utilizada juntamente com a QT para auxiliar no diagnóstico e acompanhamento do tratamento de pacientes DG.

Orientador: João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T20:09:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Valerio_AmandaAbdalla_D.pdf: 3553304 bytes, checksum: 97ba97062f1c23d4b29447c0b9a7316d (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Glicosídeo hidrolases (EC 3.2.1.-) são enzimas que hidrolisam ligações glicosídicas. Neste trabalho realizamos estudos funcionais e estruturais de duas glicosídeo hidrolases: a celulase XF0810 de Xylella fastidiosa e a lisozima digestiva 1 de Musca domestica (MdL1). A celulase XF0810 está anotada no genoma da X. fastidiosa como membro da família 5 das glicosídeo hidrolases (EC 3.2.1.4). Após a amplificação, clonagem, expressão e purificação da mesma; prosseguimos com os experimentos de filtração em gel analítica, dicroísmo circular, DLS, ensaio enzimático e cristalização desta proteína. Foi feito um estudo de modelagem onde ficou evidenciado que a XF0810 não pertenceria à família 5 pois quatro dos sete resíduos conservados que caracterizam esta família foram substituídos, incluindo os dois resíduos catalíticos de glutamato essenciais para o mecanismo de clivagem de retenção. Isto foi comprovado através da ausência de atividade nos ensaios feitos com a proteína purificada. A MdL1 pertence à família 22 das glicosídeo hidrolases (EC 3.2.1.17) e foi cristalizada com o ligante Nacetilquitotetraosídeo para a difração de raios X. A resolução da estrutura (2H5Z no PDB) foi realizada por meio do método de substituição molecular tendo como modelo a estrutura nativa. A análise comparativa da MdL1 com outras lisozimas de quatro classes diferentes de animais mostrou grande semelhança e pequenas diferenças apenas na região das voltas. Estas diferenças foram utilizadas para explicar as características especiais de uma lisozima com função digestiva. A volta na região definida pelos resíduos 98-100 apresenta uma deleção na MdL1, tornado-a menos exposta ao solvente, podendo justificar a resistência à proteólise. O resíduo Gln100 participa de uma interação com o ligante. Os resíduos Thr107 e Asn46 são apontados como responsáveis pelo decréscimo dos pKa dos grupos carboxilas dos resíduos catalíticos Glu32 e Asp50, respectivamente. A diminuição dos pKa explica o pH ótimo mais ácido característico de lisozimas digestivas / Abstract: Glycoside hydrolases (EC 3.2.1.-) are enzymes that hydrolyze glycoside bonds. In this work we studied functional and structural features of two glycoside hydrolases: the cellulase XF0810 of Xylella fastidiosa and the digestive lysozyme 1 of Musca domestica (MdL1). The cellulase XF0810 is annotated in the genome of X. fastidiosa as member of family 5 of glycoside hydrolases (EC 3.2.1.4). After the amplification, cloning, expression and purification of XF0810; we continued with the experiments of analytical gel filtration, circular dichroism, DLS, enzymatic assay and crystallization of this protein. A homology model was built which showed that XF0810 did not belong to family 5 because four of seven conserved residues that characterize the family were substituted, including the two catalytic residues of glutamate that are essential for the retention hydrolysis mechanism. This was further confirmed by the absence of activity in the assays (exocellulase with PNPc) performed with the purified protein. The MdL1 belongs to the family 22 of glycoside hydrolases (EC 3.2.1.17) and was crystallized with the ligand N-acetilchitotetraose for X-ray diffraction. The resolution of the structure (2H5Z in PDB) was accomplished by molecular replacement with the native structure as the searching model. The comparative analysis of MdL1 with other lysozymes of four different classes of animals showed a high similarity and few differences appeared only in the loops¿ regions. These differences were used to explain the special characteristics of the lysozyme with a digestive function. The loop in the region defined by residues 98-100 presents one deletion in the MdL1, becoming less exposed to the solvent, this might justify the proteolysis resistance. The residue Gln100 participates directly in an interaction with the ligand. The residues Thr107 and Asn46 are pointed out as responsible for a reduction in the pKa of the carboxyl groups of catalytic residues Glu32 e Asp50, respectively. The reduction in pKa explains the more acidic pH optimum that characterizes the digestive lysozymes / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Fabio Marcio Squina, Roberto Ruller / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T02:46:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hoffmam_ZairaBruna_M.pdf: 4922807 bytes, checksum: df6edae9e54a10424f07783fcf889151 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O etanol de segunda geração, produzido a partir dos polissacarídeos da biomassa lignocelulósica, apresenta-se como uma alternativa promissora para tornar a matriz energética brasileira sólida e, em grande parte, renovável. A biomassa é composta basicamente por celulose, hemicelulose e lignina. Celulose e hemicelulose devem ser hidrolisadas a açúcares monoméricos fermentescíveis para produzir etanol. Entretanto, a tarefa de propor um processo enzimático de hidrólise eficiente e de baixo custo com a finalidade de sacarificar a biomassa é desafiadora, pois os polissacarídeos que a compõem são complexos e recalcitrantes. Embora as hemiceluloses representem cerca de 30% dos açúcares do bagaço da cana-de-açúcar, uma das biomassas mais promissoras para a produção de etanol de segunda geração no Brasil, ainda poucos estudos são direcionados ao estudo da sacarificação dessa fração de polissacarídeos. Hemicelulases são glicosídeo hidrolases que catalisam a hidrólise dos polissacarídeos hemicelulósicos, e que em atuação sinérgica com celulases promove a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar de maneira mais eficiente que as classes de enzimas isoladamente. A primeira parte dessa dissertação apresenta a caracterização bioquímica e biofísica de uma arabinofuranosidase GH51 do micro-organismo Bacillus subtilis 168. ?-L-arabinofuranosidases são hemicelulases que hidrolisam terminais não redutores de polissacarídeos contendo arabinose. A AbfA mostrou-se robusta, atuando numa ampla faixa de temperatura, e capaz de liberar monômeros de arabinose hidrolisando 1,5-?-L-arabinoheptaose a partir da extremidade não-redutora. A análise dos dados de SAXS combinada com simulações de dinâmica molecular mostrou que a AbfA em solução é hexamérica, com cada subunidade contendo uma molécula com domínio catalítico em enovelado na forma de barril (?/?)8 seguido por um domínio acessório ?-sandwich. Esses dados evidenciam que a estrutura quaternária pode ser importante para o desempenho de atividade das arabinofuranosidases da família 51. A segunda parte da dissertação aborda uma avaliação da influência dos domínios de ligação a carboidratos na atividade de xilanases mesofílicas e termofílicas. Xilanases são hemicelulases que catalisam a hidrólise de ligações endo-1,4-?-D-xilosídicas na molécula de xilano. Fusões gênicas uniram end-to-end um CBM6 de Clostridium thermocellum aos domínios catatalíticos xilanásicos das enzimas GH10 termofílica (de Thermotoga petrophila) e GH11 mesofílica (de Bacillus subtilis 168). O CBM6 alterou o padrão de hidrólise das quimeras termofílicas e aumentou a constante de eficiência da quimera mesofílica, quando comparadas as enzimas nativas respectivas. Além disso, na hidrólise da biomassa da cana-de-açúcar a xilanase quimérica mesofílica suplementou o coquetel comercial Accellerase 1500, liberando mais açúcares redutores. Dessa forma a fusão ao CBM6 mostrou-se uma alternativa para construir enzimas com melhor desempenho cinético / Abstract: The second generation ethanol, produced from lignocellulosic biomass polysaccharides, presents itself as a promising alternative to make the Brazilian energy matrix solid and largely renewable. Biomass is composed mainly of cellulose, hemicellulose and lignin. Cellulose and hemicellulose must be hydrolyzed in fermentable monomeric sugars to produce ethanol. However, the task of proposing a process for enzymatic hydrolysis efficient and low cost in order to saccharify the biomass is challenging because its polysaccharides are complex and recalcitrant, so it requires the presence of several different catalytic activities for hydrolysis. Although hemicelluloses represent about 30% of sugars from sugarcane bagasse, one of the most promising biomass for the production of second generation ethanol in Brazil, few studies are directed to the saccharification study of this polysaccharidic fraction. Hemicellulases are glycoside hydrolases that catalyze the hydrolysis of hemicellulosic polysaccharides and works synergistically with cellulases promoting the hydrolysis of sugarcane bagasse more efficiently than each one class of enzymes alone. The first part of this dissertation presents the biochemistry and biophysics characterization of a GH51 arabinofuranosidase from microorganism Bacillus subtilis 168. ?-Larabinofuranosidases are hemicellulases that hydrolyze linkages in terminal nonreducing ends of polysaccharides containing arabinose. The AbfA showed itself robust, working in a wide temperature range, and able to release arabinose monomers hydrolyzing 1,5-?-L-arabinoheptaose from the non-reducing end. The analysis of SAXS data in combination with molecular dynamics simulations showed that AbfA solution is hexameric, with each subunit containing a molecule with catalytic domain coiled in the form of barrel (?/?)8 followed by a ?-sandwich domain accessory. These results evidence and corroborate data that the quaternary structure may be important for the activity of GH51 arabinofuranosidases family. The second part of the thesis adresses an evaluation of the influence of carbohydratebinding modules, non-catalytic domains of polysaccharides recognition, in the activity of mesophilic and thermophilic xylanases. Xylanases are hemicellulases that catalyze the hydrolysis of endo-1 ,4-?-D-xylosidic linkages in xylan molecule. Gene fusions joined end-to-end a CBM6 from Clostridium thermocellum to catalytic xylanasic domains of enzymes thermophilic GH10 (from Thermotoga petrophila) and mesophilic GH11 (from Bacillus subtilis 168). The CBM6 changed the hydrolysis pattern of thermophilic chimeras increased the efficiency constant of mesophilic chimera, when compared to the respective native enzymes. Furthermore, in the sugarcane biomass hydrolysis mesophilic chimeric xylanase supplemented the commercial cocktail Accellerase 1500, releasing more reducing sugars. In conclusion, the CBM6 fusion proved itself an alternative to construct enzymes with better kinetic performance / Mestrado / Bioquimica / Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Munir Salomão Skaf / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-24T07:03:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gomes_ThiagoCostaFerreira_D.pdf: 13438556 bytes, checksum: add103a09a2f775dbe590afd1507f3e4 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Nesta Tese foram investigados sistemas biológicos relacionados à hidrólise da biomassa lignocelulósica. O trabalho de tese está subdividido em três partes. Na primeira parte foram investigadas, mediante simulações por dinâmica molecular, as características estruturais e dinâmicas que conferem termoestabilidade a laminarinases, enzimas da família das glicosideo hidrolases de grande interesse no desenvolvimento de tecnologias viáveis para a produção industrial de etanol celulósico. Na segunda parte do trabalho, desenvolvemos e tornamos publicamente disponível um programa de computador, denominado cellulose-builder, que visa automatizar a construção de arquivos em formato PDB que representem cristalitos de celulose. Os arquivos em formato PDB gerados pelos nosso programa podem ser utilizados como configuração inicial em simulações por dinâmica molecular de sistemas que contenham fases cristalinas da celulose. O programa permite gerar cristalitos de forma e tamanho arbitrários, permitindo expor qualquer face cristalográfica de quatro alomorfos da celulose cristalina. Visando contribuir para o melhor entendimento em nível molecular da estrutura da parede celular vegetal e elucidar os modos de interação entre a celulose e a hemicelulose (dois componentes importantes da parede celular vegetal), na terceira parte deste trabalho empregamos o programa cellulose-builder para construir cristais de celulose com xilanos (hemiceluloses) adsorvidos em diversas faces cristalográficas e utilizamos simulações por dinâmica molecular para estudar em nível atômico a interação entre xilanos e diversas faces cristalográficas do alomorfo I-beta da celulose. Também investigamos o efeito de substituintes comumente presentes em hemiceluloses (acetil e glucuronil) nos parâmetros geométricos e energéticos da interação entre celulose e hemicelulose / Abstract: This Thesis comprises the study of biological systems related to the hydrolysis of lignocellulosic biomass. The work is divided in three parts. In the first part we investigated, by means of molecular dynamics simulations, the structural and dynamical features that confer thermostability to laminarinases, enzymes belonging to the glycoside hydrolase family, which are of great interest in the development of viable tecnologies aiming the industrial production of cellulosic ethanol. In the second part of the Thesis work we developed and made publicly available a computer program, named cellulose-builder, whose purpose is to automatize the construction of PDB-format files representing cellulose crystallites. The PDB-format files generated by our program can be used as starting configurations in molecular dynamics simulations of systems containing crystalline phases of cellulose. The program enables one to generate crystallites of arbitrary size and shape, making it possible to expose any crystallographic face of four cellulose allomorphs. Aiming to contribute to a better understanding of the plant cell wall structure at the molecular level and to elucidate the modes of interaction between cellulose and hemicellulose (two major components of the plant cell wall), in the third part of this work we employed the computer program cellulose-builder to set up cellulose crystals with xylans (hemicelluloses) adsorbed onto several crystallographic faces and applied molecular dynamics simulations to study, at the atomic level, the interactions between xylans and several crystallographic faces of cellulose's allomorph I-beta. We also investigated the effect of substituents commonly occurring in hemicelluloses (namely acetyl and glucuronyl) in geometric and energetic parameters resulting from the interaction between cellulose and hemicellulose / Doutorado / Físico-Química / Doutor em Quimica

Orientador: Munir Salomão Skaf / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-25T19:29:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silveira_RodrigoLeandro_D.pdf: 21325666 bytes, checksum: e2332474509730ff297050a513a97a70 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A produção de bioetanol a partir da biomassa lignocelulósica integra processos físico-químicos e enzimáticos que comprometem sua viabilidade econômica. A biomassa possui uma estrutura recalcitrante composta de celulose, hemicelulose e lignina. Tal estrutura, bem como os mecanismos das enzimas, não são bem compreendidos. Nesta tese, simulações de dinâmica molecular e a teoria mecânico-estatística 3D-RISM foram utilizada para investigar aspectos moleculares da degradação de biomassa, incluindo: (1) dinâmica estrutural de celulases; (2) base molecular da termofilicidade de laminarinaes; (3) disrupção não-hidrolítica de biomassa por expansinas; (4) nanoarquitetura da parede ceular primária; e (5) forças termodinâmicas da parede celular secundária. No tópico (1), observou-se que a acessibilidade ao substrato em celulases pode ser modulada por alterações na estrutura primária, com consequências para a atividade enzimática. Observou-se também que a inibição por produto está relacionada a alterações conformacionais de resíduos próximos ao sítio de ligação. Adicionalmente, alterações na dinâmica intrínseca das enzimas ocorrem conforme a etapa do processo de hidrólise. No tópico (2), os resultados mostraram que a conformação do sítio de ligação ao substrato de laminarinases é sensível a variações de temperatura. No tópico (3), observou-se que a expansina pode transladar sobre a superfície da celulose e induzir torções em cadeias de glucano, sugerindo a possibilidade de romper ligações de hidrogênio celulose-celulose e/ou celulose/xiloglucano como um zíper. No tópico (4), observou-se que a agregação de nanofibrilas de celulose se dá através de suas faces hidrofílicas e que a presença de hemicelulose estabiliza tal agregação. No tópico (5), os resultados mostraram que as forças de coesão da parede celular secundária são de natureza entrópica e que a composição química da lignina modula as interações lignina-lignina e lignina-hemicelulose / Abstract: Biofuel production from lignocellulosic biomass involves physico-chemical and enzymatic processes that challenge its economic viability. The lignocellulosic biomass is recalcitrant against degradation and is made up of cellulose, hemicellulose and lignin. This structure and the enzyme mechanisms are not fully understood. In this thesis, molecular dynamics simulations and the statistical mechanical theory 3D-RISM were employed to assess molecular aspects of the biomass degradation, including: (1) structural dynamics of cellulases; (2) molecular basis of the thermophilicity of laminarinases; (3) non-hydrolytic disruption of biomass by expansins; (4) primary cell wall nanoarchitecture; and (5) thermodynamic forces of the secondary cell wall. In the topic (1), we observed that cellulase substrate accessibility can be modulated through changes in its primary structure, with consequences to the enzymatic activity. Moreover, the product inhibition is related to conformational changes of residues located close to the substrate binding site. In addition, changes of the intrinsic dynamics allow cellulases change their function according to the hydrolysis step. In the topic (2), we show that the substrate binding site conformation of laminarinases is sensitive to temperature variations. In the topic (3), we observed that the expansin can translade over the cellulose surface and induce torsions in free glucan chains, suggesting the possibility of disruption of cellulose-cellulose and cellulose-xyloglucan hydrogen bonds as a ziper. In the topic (4), the results showed that the aggregation of cellulose nanofibrils takes place through their hydrophilic face and that hemicellulose plays roles in stabilizing such aggregation. In the topic (5), we observed that the cohesion forces within the secondary cell wall are of entropic origin and that the lignin chemical composition modulates the lignin-lignin and lignin-hemicellulose interactions / Doutorado / Físico-Química / Doutor em Ciências

Orientador: Mário Tyago Murakami / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T21:09:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paiva_JoiceHelena_D.pdf: 28922115 bytes, checksum: be729b855c60f1b34aac3a0b43e0aeac (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular