Orientador: Munir Salomão Skaf / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-25T19:29:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silveira_RodrigoLeandro_D.pdf: 21325666 bytes, checksum: e2332474509730ff297050a513a97a70 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A produção de bioetanol a partir da biomassa lignocelulósica integra processos físico-químicos e enzimáticos que comprometem sua viabilidade econômica. A biomassa possui uma estrutura recalcitrante composta de celulose, hemicelulose e lignina. Tal estrutura, bem como os mecanismos das enzimas, não são bem compreendidos. Nesta tese, simulações de dinâmica molecular e a teoria mecânico-estatística 3D-RISM foram utilizada para investigar aspectos moleculares da degradação de biomassa, incluindo: (1) dinâmica estrutural de celulases; (2) base molecular da termofilicidade de laminarinaes; (3) disrupção não-hidrolítica de biomassa por expansinas; (4) nanoarquitetura da parede ceular primária; e (5) forças termodinâmicas da parede celular secundária. No tópico (1), observou-se que a acessibilidade ao substrato em celulases pode ser modulada por alterações na estrutura primária, com consequências para a atividade enzimática. Observou-se também que a inibição por produto está relacionada a alterações conformacionais de resíduos próximos ao sítio de ligação. Adicionalmente, alterações na dinâmica intrínseca das enzimas ocorrem conforme a etapa do processo de hidrólise. No tópico (2), os resultados mostraram que a conformação do sítio de ligação ao substrato de laminarinases é sensível a variações de temperatura. No tópico (3), observou-se que a expansina pode transladar sobre a superfície da celulose e induzir torções em cadeias de glucano, sugerindo a possibilidade de romper ligações de hidrogênio celulose-celulose e/ou celulose/xiloglucano como um zíper. No tópico (4), observou-se que a agregação de nanofibrilas de celulose se dá através de suas faces hidrofílicas e que a presença de hemicelulose estabiliza tal agregação. No tópico (5), os resultados mostraram que as forças de coesão da parede celular secundária são de natureza entrópica e que a composição química da lignina modula as interações lignina-lignina e lignina-hemicelulose / Abstract: Biofuel production from lignocellulosic biomass involves physico-chemical and enzymatic processes that challenge its economic viability. The lignocellulosic biomass is recalcitrant against degradation and is made up of cellulose, hemicellulose and lignin. This structure and the enzyme mechanisms are not fully understood. In this thesis, molecular dynamics simulations and the statistical mechanical theory 3D-RISM were employed to assess molecular aspects of the biomass degradation, including: (1) structural dynamics of cellulases; (2) molecular basis of the thermophilicity of laminarinases; (3) non-hydrolytic disruption of biomass by expansins; (4) primary cell wall nanoarchitecture; and (5) thermodynamic forces of the secondary cell wall. In the topic (1), we observed that cellulase substrate accessibility can be modulated through changes in its primary structure, with consequences to the enzymatic activity. Moreover, the product inhibition is related to conformational changes of residues located close to the substrate binding site. In addition, changes of the intrinsic dynamics allow cellulases change their function according to the hydrolysis step. In the topic (2), we show that the substrate binding site conformation of laminarinases is sensitive to temperature variations. In the topic (3), we observed that the expansin can translade over the cellulose surface and induce torsions in free glucan chains, suggesting the possibility of disruption of cellulose-cellulose and cellulose-xyloglucan hydrogen bonds as a ziper. In the topic (4), the results showed that the aggregation of cellulose nanofibrils takes place through their hydrophilic face and that hemicellulose plays roles in stabilizing such aggregation. In the topic (5), we observed that the cohesion forces within the secondary cell wall are of entropic origin and that the lignin chemical composition modulates the lignin-lignin and lignin-hemicellulose interactions / Doutorado / Físico-Química / Doutor em Ciências

Orientador: José Camillo Novello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T19:34:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gomes_FabianaHelenaForte_M.pdf: 6688953 bytes, checksum: ffe979c84bdddab601e6a550b2872ebb (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O Brasil é o maior produtor de citros no mundo, entretanto, várias doenças ameaçam a citricultura brasileira, dentre elas o cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). A doença é caracterizada por necrose e lesões eruptivas. Sabe-se que a bactéria transloca proteínas efetoras para o interior da célula hospedeira e modula a transcrição na planta. Dentre as proteínas translocadas está à proteína PthA que por si só é capaz de induzir hiperplasia e hipertrofia tecidual. Em relação aos genes cuja expressão foi induzida pela infecção por X. citri estão àqueles envolvidos na remodelação da parede celular, síntese, mobilização e sinalização de auxina e giberelina, os quais são os principais hormônios vegetais controladores de crescimento celular. Corroborando com isso, tanto auxina como giberelina ativam a expressão de celulases e expansinas e são necessárias para o desenvolvimento do cancro cítrico. Em 2010 demonstrou-se a interação entre PthAs e a proteína ARF ("auxin response fator") de Citrus sinensis (CsARF), um possível repressor da via de auxina. O promotor do gene da expansina de citros (CsEXP), cujo gene foi induzido por X. citri e auxina contêm uma sequência similar aos chamados AuxRe, elementos cis-regulatórios de resposta à auxina, localizado adjacentemente ao provável TATA-"box". Sendo assim, analisou-se a região 5' a montante do gene CsEXP de C. sinensis a fim de saber se este representa de fato o promotor mínimo do gene e se o "box AuxRE-like" funciona como elemento regulatório de resposta à auxina. No ensaio de transformação de CsEXP para ativação do gene repórter GUS, a região promotora foi responsiva à auxina, havendo, portanto uma regulação positiva do gene pelo hormônio. Há uma interação (sinergismo) entre a proteína PthA2 e/ou PthA4 com auxina na regulação da transcrição. Esta região que contém o "box AuxRE-like" possui uma sequência TGTCTA a qual está justaposta ao possível TATA-box no promotor do gene podendo se tratar de uma região de provável co-interação entre as duas proteínas. As proteínas CsARF e PthA2, em ensaios gel "shift", demonstraram afinidade por esta região, o que corrobora com a hipótese de co-interação nessa região. Os resultados demonstram que esta região do DNA mostra se como importante alvo de estudo, envolvendo interações correlacionadas com o desenvolvimento da doença / Abstract: Brazil is the biggest in the world in the citrus production, but many diseases threaten the Brazilian citrus cultivation, among them the citric canker, a disease characterized by hyperplastic lesions on the host surface, having Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) as the causal agent of citrus canker. It is known that the bacterium translocates effector proteins into the host cell to modulate transcription in the plant, including the PthA protein which itself is capable of inducing tissue hyperplasia and hypertrophy. Recently, it was shown that X. citri induces the expression of genes involved in cell wall remodeling, synthesis, mobilization and signaling of auxin and gibberellic acid, main plant hormones controlling cell growth and division. Furthermore, auxin and gibberellin are capable to activate the expression of cellulases and expansins and both of them are necessary for the development of citrus canker. Moreover, we verified the interaction between PthA and the protein ARF (auxin response factor) of Citrus sinensis (CsARF), and that promoter of the gene of expansins citrus (CsExp) it was induced by X. citri and auxin, which contains a sequence similar to known AuxRe, cis-regulatory elements in response to auxin, located adjacent to the probable TATA-box. Therefore, we analyzed the 5' region upstream of the gene CsExp of C. sinensis in order to know if in fact represents the minimal promoter of the gene and if AuxRE-box-like functions as regulatory element in response to auxin._ In the test transformation of CsEXP for activating GUS, the promoter region was responsive to auxin, the results were promising, because the minimal promoter of the gene was responsive to auxin in vivo assays, which have confirmed the activation of the reporter gene by auxin, with therefore an upregulation of the gene by the hormone. There is a synergy between the proteins PthA2 and PthA4 with auxin in the regulation. This region contains the AuxRE-like-box which has a sequence TGTCTA which is juxtaposed to the potential TATA-box within the promoter of the gene, possibly being a region of likely joint-interaction for the two proteins._PthA2 and CsARF Proteins in gel shift tests demonstrated affinity for this region, which could confirms the hypothesis of the region to be a region of jointinteraction. The results were significant and this region of the DNA shown to be an important target for study of interactions likely correlated with the development of the disease / Mestrado / Bioquimica / Mestra em Biologia Funcional e Molecular