Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / The aim this study were (i) to map and identify proteins in seminal plasma of New Zealand white rabbits strain, using the techniques of two-dimensional electrophoresis coupled to mass spectrometry and to estimate associations between these proteins with sperm parameters and (ii) characterize expression of the nerve growth factor polypeptide beta ( -NGF) and its cognate neurotrophic receptor tyrosine kinase type 1 (NTRK1), and nerve growth factor receptor (NGFR) at gonads and sex glands in adult New Zealand white rabbits as well as the NGF concentration in seminal plasma of sexually mature animals, using RT - PCR and immunohistochemistry. Also was measured the NGF concentration in the blood and seminal plasma by ELISA. Study 1 was performed at Federal University of CearÃ, in Fortaleza-Ce. Semen samples were collected from 18 adult rabbits, using an artificial vagina. After collecting proceeded to the evaluation of semen quality parameters: total motility, individual progressive motility, sperm concentration, sperm morphology and functional tests: membrane integrity (HOST), acrosomal integrity and vitality. The seminal plasma was obtained by centrifugation of semen, and subjected to two-dimensional electrophoresis. Gels were stained with colloidal Coomassie, scanned and analyzed in PDQuest application. The individual spots were excised from the gels, digested with trypsin, and submitted to mass spectrometry (ESI-QUAD-TOF) to identification. The results were subjected to statistical analysis to verify the existence of associations between the presence and / or intensity of the spots present in the protein maps of seminal plasma with the semen quality parameters. The associations between the parameters of ejaculated sperm and the expression of seminal plasma proteins of rabbits were estimated by multiple regression models using the REG procedure of SAS statistical application (v.9.0, 2002) with STEPWISE selection. 232  69.5 spots/gel were detected with 34 spots consistently present in all gels. These 34 spots corresponded to 15% of the total number of spots, representing 32% of the optical intensity of all the spots. Mass spectrometry identified approximately 95% of the detected spots (identified: 220 spots; analyzed: 232 spots), which corresponded to 87 different proteins. The most abundant proteins were the annexins, zeta-globin, lipocalin, FAM 115 protein and a serpins cluster. Other proteins also have been identified, such as transferrin, heat shock protein, glutathione transferase and others. The NGF (protein nerve growth factor) presence also has been identified which has been reported in other species such as ovulation induction factor. This 87 proteins identified in seminal plasma of rabbits participate mainly of biological processes associated with cellular processes (65.25%), regulation (64.25%) and response to stimuli (22.9%). Significant associations were observed between the proteins identified in seminal plasma of rabbits with sperm evaluated parameters such as individual progressive motility, sperm viability, cells with morphology and functional membranes have been associated with specific proteins. Associations were observed for several proteins with the same sperm parameter. According to literature, this is first report about the proteome of seminal plasma of rabbits and its role on the seminal parameters. Knowledge of these proteins contributes to a better understanding of the regulatory mechanisms of seminal plasma on sperm function in rabbits. Study 2 was conducted at Università Degli Studi di Perugia in the city of Perugia-Pe, Italy. It was evaluated the expression of NGF protein that was previously identified during study 1. The immunoreactivity and gene expression of NGF and cognate receptors were detected in testis, prostate and seminal vesicle. The highest levels of NGF and NTRK1 transcripts were found in prostate, while intermediate expressions were found in testis. NGFR transcripts were expressed at the same level on both the testis and prostate, and were more abundant than in seminal vesicles. The widespread distribution of NGF in all glandular cells of the prostate, coupled with its high abundance of mRNA on confirm that the prostate is a major source of this neurotrophin in rabbits. In conclusion, the present data suggest that NGF is involved in developmental system and spermatogenesis of testis rabbits and that NGF can act as a potential factor for induction of ovulation, being abundantly present in seminal plasma. / Os objetivos deste estudo foram (i) mapear e identificar as proteÃnas do plasma seminal de coelhos da raÃa Nova ZelÃndia Branca, utilizando as tÃcnicas de eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massa e estimar associaÃÃes entre essas proteÃnas com os parÃmetros espermÃticos e (ii) caracterizar a expressÃo do fator de crescimento nervoso, poliptido beta ( -NGF), e os seus receptores cognatos neurotrÃficos da tirosina-quinase de tipo 1 (NTRK1) e receptor fator de crescimento nervoso (NGFR) nas gÃnadas e glÃndulas sexuais de coelhos da raÃa Nova ZelÃndia Branca, bem como as concentraÃÃes de NGF no plasma seminal de animais sexualmente maduros, utilizando as tÃcnicas de RT - PCR e imunohistoquÃmica. TambÃm foi dosada a concentraÃÃo da NGF no sangue e no plasma seminal atravÃs da tÃcnica de ELISA. O estudo 1 foi realizado na Universidade Federal do CearÃ, na cidade de Fortaleza-Ce. Foram coletados amostras de sÃmen de 18 coelhos adultos, utilizando- se uma vagina artificial. ApÃs a coleta procedeu-se a avaliaÃÃo dos parÃmetros qualidade seminal: motilidade, vigor, concentraÃÃo espermÃtica, morfologia espermÃtica e os testes funcionais: integridade de membrana, integridade acrossomal e vitalidade. O plasma seminal foi obtido pela centrifugaÃÃo do sÃmen, e submetido à eletroforese bidimensional. Os gÃis foram corados com Coomassie coloidal, digitalizados e analisados no aplicativo PDQuest. Os spots foram cortados individualmente dos gÃis, digeridos com tripsina, e submetidos à identificaÃÃo por espectrometria de massa (ESI- QUAD-TOF). Os resultados obtidos foram submetidos a avaliaÃÃo estatÃstica para verificar a existÃncia de associaÃÃes entre entre a presenÃa e/ou intensidade dos spots presentes nos mapas protÃicos do plasma seminal com os parÃmetros de qualidade seminal. As associaÃÃes entre os parÃmetros dos espermatozoides ejaculados e a expressÃo das proteÃnas do plasma seminal dos coelhos foram estimadas por modelos de regressÃo mÃltipla usando o procedimento REG do aplicativo estatÃstico SAS (v.9.0, 2002) com a seleÃÃo STEPWISE. Foram detectados 232  69,5 spots protÃicos por gel, com 34 spots presentes consistentemente em todos os gÃis. Esses 34 spots corresponderam a 15 % do total do nÃmero de spots, representando 32 % da intensidade Ãptica de todos os spots. A espectometria de massa identicou aproximadamente 95% dos spots detectados (220 spots de um total de 232), que corresponderam a 87 proteÃnas diferentes. As proteÃnas mais abundantes foram as anexinas, zeta-globina, lipocalinas, proteina FAM 115 e um grupamento de serpinas. Outras proteÃnas tambÃm foram identificadas, tais como: transferrina, heat shock protein, glutationa transferase, entre outras. TambÃm foi identificada apresenÃa da proteÃna fator de crescimento nervoso (NGF) que tem sido relatada em outras espÃcies como fator de induÃÃo à ovulaÃÃo. As 87 proteÃnas identificadas no plasma seminal de coelhos participam principalmente dos processos biolÃgicos associados a processos celulares (65,25 %), regulaÃÃo (64,25 %) e resposta a estÃmulos (22,9 %). Foram observadas associaÃÃes significativas entre as proteÃnas identificadas no plasma seminal de coelhos com os parÃmetros espermÃticos avaliados,tais como vigor, nÃmero de cÃlulas viÃveis, morfologia espermÃtica e cÃlulas com membranas funcionais foram associados com proteÃnas especÃficas. Foram observadas associaÃÃes de vÃrias proteÃnas com um mesmo parÃmetro espermÃtico. De acordo com a literatura, este representa o primeiro relato sobre o proteoma do plasma seminal de coelhos e seu papel sobre os parÃmetros seminais. O conhecimento dessas proteÃnas contribuirà para uma melhor compreensÃo dos mecanismos de regulaÃÃo do plasma seminal sobre a funÃÃo espermÃtica em coelhos. O estudo 2 foi conduzido na Università Degli Studi di Perugia, na cidade de Perugia-Pe, ItÃlia. Foi avaliada a expressÃo da proteÃna NGF que foi previamente identificada no estudo 1. A imunorreatividade e a expressÃo gÃnica da NGF e os seus receptores cognatos foram detectados nos testÃculos, prÃstata e vesÃcula seminal. Os nÃveis mais elevados de NGF e NTRK1 transcritos foram encontrados na prÃstata, enquanto expressÃes intermediÃrias foram encontradas no testÃculo. NGFR transcritos foram expressos nos mesmos nÃveis em ambos os testÃculos e da prÃstata e eram mais abundantes do que nas vesÃculas seminais. A distribuiÃÃo generalizada de NGF em todas as cÃlulas glandulares da prÃstata, juntamente com a sua abundÃncia de RNAm relativo, confirmam que a prÃstata à das principais fontes desta neurotrofina em coelhos. Em conclusÃo, os presentes dados sugerem que o sistema NGF està envolvido no desenvolvimento testicular e espermatogÃnese de coelhos e que o NGF pode atuar como um potencial fator de induÃÃo à ovulaÃÃo, sendo abundantemente presentes no plasma seminal.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:10229 |
| Date | 27 July 2015 |
| Creators | JÃsy Maria Arruda de Alencar |
| Contributors | Arlindo de Alencar Araripe Noronha Moura, Ricardo Toniolli, Airton Alencar de AraÃjo, Maria Gorete Flores Salles, LÃcia Daniel Machado da Silva |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo Integrado em Zootecnia-PDIZ, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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