CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Atualmente sÃo liberadas para comercializaÃÃo no mercado agrobiotecnolÃgico brasileiro, pelo menos, 12 variedades de algodÃo expressando proteÃnas Cry de Bacillus thruringiensis (Bt) para conferir resistÃncia ao ataque de insetos. Contudo, essas proteÃnas sÃo ativas contra lepidÃpteros, enquanto que a principal praga da cotonicultura brasileira à um coleÃptero, o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis). Neste contexto, tÃm-se feito um grande esforÃo na busca por novas molÃculas Cry ativas contra coleÃpteros. Utilizando tÃcnicas de evoluÃÃo molecular dirigida in vitro, foi desenvolvida a proteÃna mutante Cry8Ka5, que à vÃrias vezes mais tÃxica contra o bicudo do que a proteÃna original, Cry8Ka1, inicialmente descoberta. Dada a sua atividade promissora contra coleÃpteros, Cry8Ka5 està sendo utilizada para o desenvolvimento de um novo algodÃo Bt, bem como de outras culturas Bt de importÃncia econÃmica. No entanto, como parte das exigÃncias legais para a liberaÃÃo comercial de uma planta transgÃnica, essa proteÃna recombinante deve ser testada quanto a sua biosseguranÃa alimentar (BA) a fim de detectar potenciais efeitos alergÃnicos, tÃxicos e/ou antimetabÃlicos. Assim, este trabalho objetivou realizar uma ampla avaliaÃÃo de BA da proteÃna mutante Cry8Ka5 e da proteÃna Cry1Ac, jà incorporada em vÃrias culturas Bt comercializadas. A Ãltima foi utilizada como proteÃna controle ou teste dependendo do ineditismo da abordagem empregada em cada seÃÃo do trabalho. Nesse Ãmbito, a avaliaÃÃo de BA proposta cobriu desde as exigÃncias legais atà a execuÃÃo de metodologias, atà entÃo, nunca propostas para avaliaÃÃo de seguranÃa de consumo de produtos de Bt. Para tanto, este trabalho estruturou-se em quatro capÃtulos. O CapÃtulo 1 objetivou realizar uma revisÃo da literatura acerca do estado da arte das plantas Bt e proteÃnas Cry, bem como fornecer um entendimento geral sobre os conceitos e a legislaÃÃo vigente em BA de plantas GM. Jà o CapÃtulo 2 objetivou avaliar a BA da entomotoxina mutante Cry8Ka5 atravÃs do mÃtodo de duas etapas baseado em pesos de evidÃncia que, por sua vez, atende a todas as recomendaÃÃes da CTNBio. Neste caso, a proteÃna Cry1Ac foi utilizada como controle experimental, pois abordagens similares jà foram realizadas com essa molÃcula. Baseando-se nos mÃtodos oficiais, à possÃvel concluir que nÃo à esperado qualquer risco associado ao consumo da proteÃna Cry8Ka5 devido aos seguintes resultados encontrados: 1. Produtos Bt mostraram ter longo histÃrico de uso seguro; 2. A proteÃna Cry8Ka5 nÃo mostrou similaridade significativa de sua sequÃncia de aminoÃcidos primÃria com proteÃnas alergÃnicas, tÃxicas e/ou antinutricionais; 3. As proteÃnas Cry mostraram possuir modo de aÃÃo bastante compreendido e elevada especificidade contra insetos; 4. Cry8Ka5 foi altamente susceptÃvel à digestÃo em fluÃdo gÃstrico simulado; 5. A proteÃna Cry8Ka5 nÃo causou efeitos adversos relevantes em camundongos (5.000 mg de proteÃna/Kg de peso corpÃreo, via oral, dose Ãnica). Por sua vez, o CapÃtulo 3 objetivou avaliar a proteÃna Cry8Ka5 e a Cry1Ac quanto aos seus efeitos cito- e genotÃxicos em uma sÃrie de testes clÃssicos e alternativos, alÃm de pesquisar seus efeitos antimicrobianos. As proteÃnas nÃo causaram efeitos cito- ou genotÃxicos em linfÃcitos humanos (ambas com CI50 > 1.000 Âg/mL em todos os testes), nÃo promoveram hemÃlise em suspensÃes de eritrÃcitos de humanos (tipos A, B, AB e O), de coelho e rato (ambas com CI50 > 1.000 Âg/mL para todas as espÃcies), enquanto somente a Cry8Ka5 causou alteraÃÃes na topografia de membrana celular de eritrÃcitos humanos do tipo O, na concentraÃÃo de 1.000 Âg/mL, detectadas via microscopia de forÃa atÃmica. AlÃm disso, as proteÃnas Cry8Ka5 e Cry1Ac nÃo apresentaram citotoxicidade elevada contra naÃplios de Artemia sp. (CL50 > 700 e > 1000 Âg/mL, respectivamente) e nÃo inibiram o crescimento de quatro cepas de bactÃrias e quatro de leveduras (ambas com CIM > 1.000 Âg/mL para todos os microrganismos testados). Por fim, o CapÃtulo 4 objetivou avaliar os efeitos das proteÃnas Cry8Ka5 e Cry1Ac e de um âpoolâ de peptÃdeos de cada uma (Cry8Ka5-pep e Cry1Ac-pep, respectivamente), obtidos por digestÃo sequencial in vitro, sobre o perfil de expressÃo gÃnica de cÃlulas de carcinoma de mama MCF-7 e de carcinoma de cÃlon Caco-2, ambas de origem humana. Nenhuma das amostras testadas causou alteraÃÃes no perfil de expressÃo gÃnica das cÃlulas Caco-2 diferenciadas (utilizadas como um modelo de epitÃlio intestinal humano), mesmo quando testadas em alta concentraÃÃo (100 Âg/mL). Nos testes de exposiÃÃo com cÃlulas MCF-7 indiferenciadas, apenas a proteÃna Cry1Ac causou alteraÃÃes significativas no padrÃo de expressÃo gÃnica. Contudo, esse efeito nÃo foi detectado apÃs tratamento dessas cÃlulas com a amostra digerida de Cry1Ac (Cry1Ac-pep), que, por sua vez, mimetiza melhor as condiÃÃes reais de exposiÃÃo Ãs molÃculas Cry. As abordagens experimentais utilizadas nos trÃs Ãltimos capÃtulos mostraram-se bastante Ãteis e, apÃs tudo que foi exposto, foi possÃvel confirmar o carÃter inÃcuo da proteÃna Cry1Ac, bem como concluir que a proteÃna Cry8Ka5 à uma ferramenta biotecnolÃgica segura para o desenvolvimento de plantas de algodÃo Bt para conferir resistÃncia ao ataque do bicudo-do-algodoeiro. / Currently at least 12 varieties of cotton expressing Cry proteins from Bacillus thruringiensis (Bt) are released for sale in Brazil to confer resistance to insect attack. However, these proteins are active against lepidopteran, whereas the major pest of Brazilian cotton is a beetle, the cotton boll weevil (Anthonomus grandis). In this context, great efforts have been dedicated in the search for new Cry molecules active against coleopteran. Using techniques of in vitro directed molecular evolution, the Cry8Ka5 mutant protein was developed, which is several times more toxic against the boll weevil than the original protein, Cry8Ka1, initially discovered. Given its promising activity against coleopteran, Cry8Ka5 is being used for the development of a new Bt cotton, as well as of other Bt crops of economic importance. However, as part of legal requirements for the commercial release of a transgenic plant, the recombinant products should be tested for their food safety (FS) in order to detect potential allergenic, toxic and antimetabolic effects. This study aimed to perform a comprehensive FS assessment of the Cry8Ka5 mutant protein and of the Cry1Ac protein, already incorporated in several commercialized Bt crops. The latter was used as a protein control or test depending on the originality of the approach used in each section of this work. The FS evaluation performed covered not only the legal requirements but also the implementation of methodologies hitherto never proposed to assess the safety of consumption of Bt. For that, this study was structured in four chapters. Chapter 1 aimed to conduct a literature review on the state of the art of Bt plants and Cry proteins, as well as provide a general understanding of the concepts and current legislation in GM plants FS. Chapter 2 aimed to evaluate the FS of Cry8Ka5 mutant entomotoxin through the two-step method based on weights of evidence that, in turn, meets the recommendations of CTNBio. In this section, the Cry1Ac protein was used as experimental control, since similar approaches have already been performed with this molecule. Based on official methods, we conclude that it is not expected any risk associated with consumption of protein Cry8Ka5 due to the following results found: 1. Bt products were shown to have a long history of safe use, 2. The protein showed no significant similarity in its primary amino acid sequence with known allergenic, toxic and/or antinutritional proteins; 3. The mode of action and high specificity against insects of Cry proteins are well known; 4. Cry8Ka5 was highly susceptible to digestion in simulated gastric fluid; 5. The protein Cry8Ka5 caused no significant adverse effects in mice (5,000 mg protein/kg body weight, orally, single dose). Chapter 3 aimed to evaluate the Cry8Ka5 and Cry1Ac proteins as to their cyto- and genotoxicity in a serie of conventional and alternative tests as well as antimicrobial effects. The proteins did not cause cyto- or genotoxic effects in human lymphocytes (both with IC50 > 1,000 Âg/mL in all tests), did not cause hemolysis in human (types A, B, AB and O), rabbit and rat (both with IC50 > 1,000 Âg/mL for all species) rythrocytes, but only Cry8Ka5 caused changes in the topography of the cell membrane of human O type erythrocytes at a concentration of 1,000 Âg/mL, detected by atomic force microscopy. Furthermore, the Cry8Ka5 and Cry1Ac proteins showed no cytotoxicity against Artemia sp. nauplii (LC50 > 700 and >1000 Âg/mL, respectively), and did not inhibit the growth of four strains of bacteria and four of yeasts (both with MIC > 1,000 Âg/mL for all microrganisms tested). Finally, Chapter 4 aimed to evaluate the effects of Cry8Ka5 and Cry1Ac proteins and of a "pool" of peptides of each one (Cry8Ka5-pep and Cry1Ac-pep, respectively), obtained by in vitro sequential digestion, on the gene expression profile of MCF-7 breast carcinoma cells and Caco-2 colon carcinoma cells, both human. No sample caused changes in the gene expression profile of differentiated Caco-2 cells (used as a model for human intestinal epithelium), even when tested at high concentration (100 Âg/mL). In the exposure tests with undifferentiated MCF-7 cells, only Cry1Ac (at 100 Âg/mL) caused significant changes in the gene expression pattern. However, this effect was not detected after treatment of these cells with the sample digested of Cry1Ac Cry1Ac-pep), which, in turn, better mimic actual conditions of exposure to Cry molecules. The experimental approaches used in the last three chapters were quite useful and, after all the above, it was possible to confirm the harmless nature of the Cry1Ac protein and conclude that the Cry8Ka5 protein is a safe biotechnological tool for the development of Bt cotton plants to confer resistance against the cotton boll weevil attack.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:6848 |
| Date | 13 March 2013 |
| Creators | Davi Felipe Farias |
| Contributors | Ana de FÃtima Fontenele Urano Carvalho, VÃnia Maria Maciel Melo, Maria FÃtima Grossi de SÃ, FlÃvio Finardi Filho, Adrianus Antonius Cornelis Maria Peijnenburg |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em BioquÃmica, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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