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Previous issue date: 2015 / Instituto Carlos Chagas / Durante a metaciclogênese in vitro, a forma epimastigota de Trypanosoma
cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, se diferencia em tripomastigota
metacíclica após ser submetido a estresse nutricional em meio TAU, com isso,
adquire a capacidade de infectar o hospedeiro vertebrado. Durante a
diferenciação, os parasitas sofrem diversas adaptações que incluem a
modulação de modificações pós-traducionais. Em um trabalho recente, nosso
grupo delineou, sem quantificar, o perfil de fosforilação em T. cruzi durante a
metaciclogênese. Neste trabalho, visando realizar a quantificação dos sítios de
fosforilação, foi utilizada a metodologia SILAC, que marca proteínas durante o
cultivo celular, através da incorporação de aminoácidos contendo isótopos
pesados. Visando compreender a sinalização através de fosforilação que
ocorre nos momentos iniciais de metaciclogênese, ou seja, durante o estresse
nutricional, foram selecionados os pontos epimastigotas em crescimento
exponencial (epimastigotas 3 dias, EPI-3D) e na fase estacionária
(epimastigotas 5 dias – EPI-5D), bem como alguns pontos ao longo do estresse
nutricional (5 e 15 minutos, 1 e 2 horas). Para cada ponto experimental, os
peptídeos foram digeridos, fracionados por FR básica, então os fosfopeptídeos
foram enriquecidos utilizando beads de TiO2, e analisados por LC-MS/MS.
Foram identificados 5.405 grupos de proteínas, 1.679 grupos de fosfoproteínas,
3.893 grupos de sítios de fosforilação sendo 3049 em Serina, 786 em Treonina
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e, 58 em Tirosina, entre os quais cerca de 99% foram quantificados. As
análises foram realizadas de duas formas: inicialmente comparando as
diferentes fases de cultivo celular (exponencial e estacionária), e os diferentes
pontos ao longo do estresse nutricional. Foram observadas diversas alterações
no perfil de expressão das proteínas e modulação dos sítios de fosforilação,
envolvidos em diversos processos como síntese de ácidos graxos, sinalização
celular, locomoção, estresse oxidativo, processamento de RNA, entre outros.
Projetos “ômicos”, assim como este, são importante para gerar listas com um
número limitado de alvos para posterior caracterização. Nesse sentido, nós
objetivamos caracterizar alguns dos elementos apontados visando elucidar o
“gatilho” da metaciclogênese. / During metacyclogenesis in vitro, the epimastigote form of Trypanosoma cruzi,
etiologic agent of Chagas disease, differentiates into metacyclic trypomastigote,
after nutritional stress in TAU medium, and acquires capability to infect the
vertebrate host. During differentiation, the parasites suffer several adaptations
that include modulation of post-translational modulations. In a recent work, our
group outlined, without quantifying, the protein phosphorylation profile of T.
cruzi during metacyclogenesis. Here, in order to accomplish the quantification
the phosphorylation sites, we applied the SILAC methodology, which labels
proteins by incorporation of amino acids containing heavy isotopes, in culture.
Aiming to understand the signaling that occurs through phosphorylation in the
initial moments of metacyclogenesis, that is, during the nutritional stress,
epimastigotes in exponential growth (Epimastigote 3 days, EPI-3D) and in the
late log phase (Epimastigote 5 days, EPI-5D), as well as several points during
the nutritional stress (5 and 15 minutes, 1 and 2 hours) were selected. For each
experimental point, peptides were digested, fractionated by basic RP, then
phosphopeptides were enriched with TiO2 beads, and analyzed by LC-MS/MS.
In total, 5,405 proteins groups were identified, including 1,679 groups of
phosphoproteins and 3,893 phosphorylation sites, being 3,049 in Serine, 786 in
Threonine and, 58 in Tyrosine residues, among which around 99% were
quantified. The analyzes were performed in two ways: first comparing the
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different stages of cell growth (exponential and stationary), and the different
points along the nutritional stress. Several changes were observed in the
expression profile of the proteins and modulation of the phosphorylation sites,
involved in various processes such as fatty acid synthesis, cell signaling,
mobility, oxidative stress, RNA processing, among others. Omics projects like
this one are important to generate lists that have limited number of targets for
further characterization. In this sense we aim to characterize some of the
elements pinpointed to elucidate the trigger of metacyclogenesis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/12726 |
| Date | January 2015 |
| Creators | LUCENA, ALINE CASTRO RODRIGUES |
| Contributors | Godoy, Lyris M. F. de, Souza, Tatiana de A. C.B. de, Ornelas, Carlos André, Holetz, Fabíola Barbieri, Marchini, Fabricio K. |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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