As infecções sistêmicas causadas por Candida spp. representam importante causa de morbidade e mortalidade em pacientes pediátricos internados em unidades de cuidados intensivos. A utilização de fármacos imunodepressores em pacientes submetidos a transplantes, antibioticoterapia prolongada, nutrição parenteral, presença de cateter venoso central, entre outros fatores, contribuem para o aumento na freqüência destas infecções oportunísticas. Embora Candida albicans permaneça como a espécie mais freqüentemente isolada de episódios de candidemia, tem ocorrido aumento do número de infecções causadas por espécies não albicans. Os métodos convencionais de cultivo apresentam sensibilidade limitada, além de demandar tempo prolongado para a identificação das espécies infectantes. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) requer pequenos volumes de sangue para análise, situação ideal para crianças gravemente enfermas, propiciando diagnóstico rápido e identificação precisa das espécies de Candida. Este estudo teve como objetivos padronizar técnicas de PCR de dupla amplificação, para identificar cinco espécies de Candida em amostras de sangue de pacientes pediátricos com risco de desenvolver candidemias, e comparar os resultados com as hemoculturas. Foram analisadas amostras de sangue de 80 pacientes pediátricos internados na Unidade de Terapia Intensiva do Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da FMUSP, alocados em dois grupos: 58 pacientes que apresentavam duas ou mais condições predisponentes que elevam o risco de infecção fúngica (Grupo 1); e 22 pacientes em condições clínicas de menor gravidade e risco mais baixo, que foram estudados para avaliação da freqüência de resultados falso-positivos por PCR (Grupo 2). A primeira amplificação identificou fragmento da região ITS do DNA ribossômico, e a segunda etapa amplificou fragmentos espécie-específicos para C.albicans, C.glabrata, C.parapsilosis, C.tropicalis e C.krusei. Para as amostras com detecção de Candida spp. somente por PCR, foram realizadas restrições enzimáticas e seqüenciamentos, para a confirmação da especificidade dos amplificados. A concordância entre os resultados das hemoculturas e das PCR foi avaliada pelo teste de McNemar, com nível de significância de 5%. As hemoculturas foram positivas em 15,5% dos pacientes do grupo 1, enquanto as amplificações por PCR detectaram DNA de Candida spp. em 25,9% dos casos, incluindo todos os pacientes com culturas positivas. Houve concordância na identificação das espécies em 88,9% dos casos. Em dois pacientes, a PCR identificou mais de uma espécie infectante, o que não ocorreu pelas hemoculturas. Nos seis casos em que somente a PCR detectou Candida spp. nas amostras de sangue, as restrições enzimáticas e os seqüenciamentos confirmaram a especificidade das amplificações. No grupo 2, as hemoculturas foram negativas em todos os 22 casos, e a PCR detectou C.glabrata em um paciente, cujos amplificados, após seqüenciamento, apresentaram 98% de homologia com o protótipo. O teste de McNemar mostrou que a discordância encontrada entre os métodos é estatisticamente significante e favorece a PCR (p = 0,031). Os resultados do presente estudo demonstraram que a técnica de PCR apresentou maior poder de detecção de Candida spp. em amostras de pacientes com risco de desenvolver candidemia, quando comparada às hemoculturas. A PCR foi ainda capaz de detectar mais de uma espécie infectante na mesma amostra de sangue / Disseminated candidiasis is an important cause of morbidity and mortality in immunocompromised and critically ill pediatric patients. Increased use of immunosupressive drugs, indwelling catheters, broad-spectrum antibiotics, parenteral nutrition and other predisposing conditions have contributed to the increment of Candida bloodstream infections. Although Candida albicans remains the leading species, a growing number of nonalbicans isolates has been reported. Laboratory diagnosis of candidemia is troublesome due to the lack of blood cultures sensitivity. Detection of Candida DNA by polymerase chain reaction (PCR) in tiny blood volumes may provide a more rapid and reliable candidemia detection in critically ill children. The present study aimed at standardizing nested-PCR amplifications for identification of five Candida species, comparing results with those obtained by blood cultures. Eighty patients admitted to the pediatric intensive care unit of the Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo were divided into two groups: 58 patients presenting with two or more predisposing conditions to develop candidemia (Group 1), and 22 patients with lower risk, enrolled to establish the frequency of PCR false-positive results (Group 2). Nested amplifications were targeted to Candida ITS sequence, the first round yielding a gender specific fragment, and the second round identified five Candida species corresponding to C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis and C. krusei. When PCR positive results were not confirmed by blood cultures, enzymatic restriction and DNA sequencing were performed. Agreement between both methods was assessed by the McNemar test, adopting a level of significance of 5%. Blood cultures were positive in 15.5% of group 1 patients, whereas nested-PCR identified Candida species in 25.9%, including all culture positive patients. PCR was 88.9% concordant with blood cultures species identification, but only the molecular technique identified dual candidemia in two patients. Amplification products of six patients with negative blood cultures submitted to enzymatic restriction and sequencing analysis showed high degree of homology with Candida reference strains, confirming the specificity of PCR. Blood cultures were negative in all patients of group 2, but PCR detected C.glabrata in one case whose amplification products resulted in 98% of homology with the reference strain. The McNemar test showed disagreement between both methods, favoring PCR (p=0.031). In the present study, PCR was more sensitive to detect Candida species in comparison to blood cultures, being also able to identify dual candidemia
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-09062009-144701 |
| Date | 23 January 2009 |
| Creators | Negro, Gilda Maria Barbaro Del |
| Contributors | Okay, Thelma Suely |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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