Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to characterize the Grb10 and Grb14 mRNA and protein
expression in COCs derived from follicles of different stages of development (1-3, 4-6, 6-8
and >8mm in diameter) and determinate the involvement of the estradiol in the Grb10 and/or
Grb14 mRNA expression. Firstly, a pool of the 80 COCs from follicles at 3 to 8mm was used
to demonstrate Grb14 and Grb10 mRNA expression in denuded oocytes and respective
cumulus cells. The expression was detected in oocyte and cumulus cells. To characterize the
experimental model, oocytes from different follicle size were submitted to nuclear maturation
assessment and evaluated for competence to reach metaphase II. Maturation competence
began in oocytes from follicles larger than 2mm in diameter (P<0,01) and increased
throughout follicular development, since, oocytes from follicles of 1-3mm and 4-6mm had
lower maturation rate than those from follicles of 6-8 and >8mm (P<0,05). In the first
experiment, Grb10 and Grb14 mRNA expression was assessed by qRT-PCR in COCs from
different follicle size. The expression of Grb10 mRNA in oocytes from 1-3 and 4-6mm
follicles was higher (P<0,05) than those from 6-8 and >8mm follicles. However the Grb14
mRNA relative expression was higher in oocytes of group 1-3mm decreasing (P<0,05) as the
follicle size increase. In addition, we performed the localization of the Grb10 protein by
immunofluorescence analysis. Positive fluorescence signal for Grb10 was detected in all
analyzed samples. To evaluate an hormonal influence on the Grb10 and Grb14 mRNA
expression, oocytes from follicles at 3-8mm were cultured in the presence of follicular cells in
medium supplemented with 17β-estradiol and/or fulvestrant (an estradiol antagonist). The
mRNA expression did not show statistical difference between treatments groups (P>0,05).
Based on this results, we conclude that Grb10 and Grb14 mRNA and Grb10 protein are
expressed COCs in cattle. In addition, the differential expression observed in COCs from
different follicle size suggest an involvement of the Grb10 and Grb14 genes in the bovine
oocyte competence. / O objetivo do presente trabalho foi caracterizar as proteínas Grb10 e Grb14 em
complexos cumulus-oócito (CCOs) de bovinos oriundos de folículos em diferentes fases de
desenvolvimento e mostrar o envolvimento do estradiol na regulação da expressão de RNAm.
Primeiramente, foram obtidos pool de CCOs de folículos de 3-8mm para verificar a expressão
de RNAm para Grb10 e Grb14 no oócito desnudo e nas células do cumulus. Tanto o oócito
quanto as células do cumulus expressaram RNAm para as proteínas em estudo. Com o intuito
de caracterizar o modelo experimental utilizado, foi verificado que a competência à
progressão meiótica se da em oócitos oriundos de folículos com diâmetro >2mm (P<0,01) e
aumenta ao longo do desenvolvimento folicular, já que, oócitos oriundos de folículos de 1-3 e
4-6mm apresentam taxas de maturação inferiores aos oócitos oriundos de folículos de 6-8 e
>8mm (P<0,05). O primeiro experimento foi delineado com o intuito de demonstrar uma
expressão diferencial de mRNA para as proteínas Grb10 e Grb14 ao longo do
desenvolvimento folicular. Para isso os grupos de CCOs (1-3, 4-6, 6-8 e >8mm) foram
submetidos a extração RNA e transcrição reversa. A expressão relativa dos genes foi realizada
por PCR em tempo real. Nesse experimento foi verificado que a expressão do gene Grb10 em
CCOs esteve elevada nos grupos 1-3 e 4-6mm, diminuindo nos grupos 6-8 e >8mm (P<0,05).
Já a expressão de mRNA de Grb14 esteve alta no grupo 1-3, diminuindo (P<0,05) conforme o
aumento do tamanho folicular. Além disso, foi realizada a localização da proteína Grb10 pela
técnica de imunofluorescência. A proteína Grb10 foi localizada tanto no oócito como no
cumulus dos grupos de CCOs (1-3, 4-6, 6-8 e >8mm) porém a localização foi mais evidente
em CCOs oriundos de folículos com diâmetro <6mm. Com o intuito de identificar uma
influência hormonal na regulação da expressão de Grb10 e Grb14, foi realizado um terceiro
experimento no qual CCOs oriundos de folículos de 3-8mm foram co-cultivados com metades
foliculares em meio suplementado com estradiol-17β e/ou fulvestrant (antagonista do
estradiol) durante 6h. A expressão de RNAm não apresentou diferença significativa entre os
tratamentos (P>0,05). Com base nesses resultados pode-se concluir que há expressão de
RNAm para Grb10 e Grb14 bem como localização da proteína Grb10 em CCOs de bovinos, e
que a expressão diferencial de RNAm sugere um envolvimento desses genes na aquisição de
competência oocitária ao longo do desenvolvimento folicular. Portanto novos estudos
precisam ser feitos para entender um mecanismo de regulação na expressão de RNAm.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsm.br:1/10102 |
| Date | 31 August 2011 |
| Creators | Rosa, Paulo Roberto Antunes da |
| Contributors | Gonçalves, Paulo Bayard Dias, Barreto, Katia Padilha, Mondadori, Rafael Gianella |
| Publisher | Universidade Federal de Santa Maria, Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, UFSM, BR, Medicina Veterinária |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSM, instname:Universidade Federal de Santa Maria, instacron:UFSM |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 500500000007, 400, 500, 500, 300, 300, fcd33ccc-f08d-428c-b7da-9d3757cf0a96, 2a9e5e52-bb40-426e-840c-ee1760d84eea, 75e93ed0-dd8e-4526-a6ea-9b1154752ca3, d3b1aec5-37ba-4f25-82cc-2045f5beb8ff |
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