CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A histoplasmose, causada pelo fungo dimÃrfico Histoplasma capsulatum, à a mais prevalente das micoses sistÃmicas nas AmÃricas, sendo frequentemente observada em pacientes com AIDS. Desde o inÃcio da epidemia de HIV, na dÃcada de 80, existe um aumento significativo no nÃmero de casos de histoplasmose no Estado do CearÃ, Nordeste do Brasil. A escassez de dados epidemiolÃgicos dos genÃtipos que circulam na regiÃo Nordeste ressalta a importÃncia de estudos mais detalhados sobre a epidemiologia molecular de H. capsulatum nessa regiÃo. Diferentes tÃcnicas moleculares tÃm sido utilizadas para melhor caracterizar o padrÃo genÃtico de cepas de H. capsulatum circulantes no mundo. Vale ressaltar que, grande parte dos estudos de H. capsulatum à realizada na sua fase leveduriforme, quando expressa as suas caracterÃsticas parasitÃrias. Assim, o uso de tÃcnicas laboratoriais para a conversÃo in vitro para a fase leveduriforme e sua manutenÃÃo à extremamente importante. Diante do exposto, o presente estudo objetivou averiguar a taxa de conversÃo in vitro dos isolados de H. capsulatum em seis meios de cultura diferentes, bem como detectar, atravÃs da tÃcnica de PCR, a presenÃa do gene ryp1, um importante regulador transcricional da conversÃo da fase filamentosa para leveduriforme. AlÃm disso, visou conhecer o perfil molecular de cepas de H. capsulatum, de origem humana e veterinÃria, oriundas do Estado do Cearà e da regiÃo Sudeste do Brasil, atravÃs da tÃcnica de RAPD-PCR e avaliar a diversidade genÃtica da regiÃo ITS1-5.8S-ITS2 desses isolados comparados com isolados de outros paÃses, atravÃs do sequenciamento do DNA ribossÃmico nuclear. No estudo de conversÃo in vitro, todos os meios testados foram capazes de possibilitar a conversÃo de fases, contudo, o meio Ãgar Sabouraud suplementado com 10% de sangue de carneiro mostrou a maior capacidade de conversÃo em relaÃÃo aos outros meios testados. O gene ryp1 foi detectado em 18 cepas de H. capsulatum (de origem humana e animal) e em trÃs espÃcimes clÃnicos positivos para H. capsulatum (sangue total) testados, nÃo sendo detectado, contudo, em isolados de Candida albicans, Paracoccidioides brasiliensis, Sporothrix schenckii e Coccidioides posadasii. A anÃlise da variabilidade genÃtica dos isolados de H. capsulatum, pela tÃcnica de RAPD-PCR, permitiu a detecÃÃo de dois clusters que circulam no Estado do CearÃ. O cluster 1 incluiu cepas das regiÃes Sudeste e Nordeste do Brasil, sendo observado dentro desse cluster a separaÃÃo dos isolados em trÃs subgrupos distintos (subgrupos 1a,1b e 1c). O cluster 2, por sua vez, incluiu somente cepas da regiÃo Nordeste do Brasil. NÃo foram observadas diferenÃas nas caracterÃsticas clÃnicas e epidemiolÃgicas dos indivÃduos cujas cepas pertenciam aos diferentes agrupamentos, obtidos pela tÃcnica de RAPD-PCR. O sequenciamento da regiÃo ITS1-5.8S-ITS2 possibilitou a detecÃÃo de dois clados principais. O clado 1 foi constituÃdo da maioria das cepas analisadas, inclusive as cepas da regiÃo Nordeste e incluiu isolados de localizaÃÃes geogrÃficas distintas. O clado 2, por sua vez, foi constituÃdo exclusivamente de isolados oriundos do Estado do Rio de Janeiro. Portanto, pode-se concluir que o Ãgar Sabouraud suplementado com 10% de sangue de carneiro apresentou maior capacidade de conversÃo das cepas de H. capsulatum em relaÃÃo aos outros meios testados, podendo ser considerado o meio de escolha para conversÃo de cepas de H. capsulatum. Ademais, o gene ryp1 pode ser utilizado para identificar isolados de H. capsulatum, bem como, detectar a presenÃa do fungo em amostras clÃnicas, podendo ser utilizado para diagnÃstico de histoplasmose. Por fim, os isolados de H. capsulatum oriundos do Estado do Cearà podem ser agrupados em dois clusters principais, detectados atravÃs da tÃcnica de RAPD-PCR. AlÃm disso, a anÃlise filogenÃtica da regiÃo ITS1-5.8S-ITS2 revelou que as cepas da regiÃo Nordeste apresentaram diferenÃas genÃticas quando comparadas com as cepas de outras regiÃes brasileiras, ficando agrupadas em um cluster diferente das mesmas. / Histoplasmosis, caused by the dimorphic fungus Histoplasma capsulatum, is the most prevalent systemic mycosis in the Americas and it is frequently observed in AIDS patients. Since the beginning of the HIV epidemic, there has been a significant increase in the number of histoplasmosis cases in the Cearà state, Northeast Brazil. The lack of epidemiological data of the genotypes circulating in the Northeast region shows the importance of more detailed studies on the molecular epidemiology of H. capsulatum in this region. Different molecular techniques have been used to better characterize the genetic profile of H. capsulatum strains. It is noteworthy that, most studies of H. capsulatum are performed in the yeast phase due to its parasitic characteristics. Thus, the use of laboratory techniques for in vitro conversion and maintenance is extremely important. Given the above, this study aimed to determine the in vitro conversion rate of H. capsulatum isolates in six different culture media, as well as to detect by PCR the presence of ryp1 gene, an important transcriptional regulator of the conversion from filamentous to yeast phase. In addition, it aimed to establish the molecular profile of H. capsulatum strains, from human and veterinary source, from Cearà and Southeast region of Brazil through RAPD-PCR assay and to assess the genetic diversity of the ITS1-5.8S-ITS2 region of these isolates compared with isolates from other countries, through the sequencing of nuclear ribosomal DNA. In the study of in vitro conversion, all tested media allowed the conversion, however, the Sabouraud agar media supplemented with 10% sheep blood showed the highest conversion capacity in relation to the other tested media. The ryp1 gene was detected in 18 H. capsulatum strains (from human and animal source) and in three tested clinical specimens (whole blood), not being detected, however, in isolates of Candida albicans, Paracoccidioides brasiliensis, Sporothrix schenckii and Coccidioides posadasii. The analysis of the genetic variability of the H. capsulatum isolates, by RAPD-PCR assay, allowed the detection of two clusters circulating in the state of CearÃ. The first cluster included strains from Southeast and Northeast regions of Brazil, being observed, within this cluster, the separation of isolates into three distinct subgroups (subgroups 1a, 1b and 1c). The second cluster included only strains from Northeast region of Brazil. There were no differences in clinical and epidemiological characteristics of individuals whose isolates belonged to different groups, obtained by RAPD-PCR. The sequencing of the ITS1-5, 8S-ITS2 region allowed the detection of two major clades. The clade 1 comprised the majority of the isolates tested, including strains from the Northeast, and included isolates from different geographical locations. The clade 2 was composed exclusively of isolates from the state of Rio de Janeiro. Therefore, it can be concluded that the Sabouraud agar supplemented with 10% sheep blood showed higher conversion capacity of H. capsulatum strains compared to the other tested media, and may be considered the medium of choice for converting of H. capsulatum strains. Furthermore, the ryp1 gene can be used to identify and detect H. capsulatum from clinical specimens, may be used for diagnosis of histoplasmosis. Finally, the H. capsulatum isolates from the state of Cearà can be grouped into two main clusters, detected by RAPD-PCR. In addition, phylogenetic analysis of the ITS1-5.8S-ITS2 region revealed that strains from the Northeast presented genetic differences compared with strains from other Brazilian regions, being grouped in a different cluster of them.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:6587 |
| Date | 13 December 2012 |
| Creators | Joyce Fonteles Ribeiro |
| Contributors | Josà JÃlio Costa Sidrim, Maria Fatima da Silva Teixeira, Maria Auxiliadora Bezerra Fechine, Raimunda SÃmia Nogueira Brilhante, Tereza de Jesus Pinheiro Gomes Bandeira |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em Microbiologia MÃdica, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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