A biologia da reprodução sexual de plantas é um campo de pesquisa de grande importância, já que a maioria dos alimentos consumidos pelo homem é composta de partes reprodutivas das plantas (frutos e sementes), oriundas do desenvolvimento de partes do pistilo fertilizado. Em Nicotiana tabacum, identificou-se um gene específico de estigma/estilete, SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), que atua na inibição da proliferação celular (DePaoli et al., 2011). Através de ensaios de pull-down, verificou-se a interação da proteína SCI1 com uma proteína quinase dependente de ciclina (CDK) (Strini, dados não publicados). Este trabalho visou à caracterização dessa nova CDK, ortóloga da CDKG;2 de Arabidopsis. A sequência correspondente de N. tabacum (NtCDKG;2) foi amplificada por PCR, a partir de cDNAs de estigmas/estiletes, clonada e sequenciada, o que permitiu a confirmação de sua identidade. A expressão de NtCDKG;2 foi analisada nos diferentes órgãos vegetativos e reprodutivos, por qRT-PCR, o que evidenciou um perfil de expressão ubíqua. Ao estudar o perfil de expressão desse gene nos estigmas/estiletes dos doze estádios de desenvolvimento floral de N. tabacum, observa-se que NtCDKG;2 é mais expresso nos estádios tardios do desenvolvimento em direção à antese, indicando uma função importante de sua proteína ao final do desenvolvimento do pistilo. Análises de expressão de NtCDKG;2 em estigmas/estiletes, de plantas de N. tabacum com produção aumentada do hormônio auxina no pistilo, sugerem que NtCDKG;2 é regulado transcricionalmente por esse hormônio. A expressão transiente da proteína de fusão NtCDKG;2-GFP, em folhas de N. tabacum, evidenciou a localização nuclear da proteína em estudo. Também foram geradas plantas transgênicas estáveis com superexpressão e com silenciamento por RNAi de NtCDKG;2. Apesar dos altos níveis de transcritos de NtCDKG;2 nas plantas de superexpressão e dos baixos níveis nas plantas silenciadas, não foram observadas alterações fenotípicas macroscópicas nessas plantas. Adicionalmente, obteve-se a expressão da proteína NtCDKG;2, fusionada a uma tag de histidina em sua porção N-terminal, em células de Escherichia coliBL21(DE3)CodonPlusRP. Através dos estudos realizados neste trabalho e análises conjuntas da literatura, é possível propor que NtCDKG;2 codifique uma proteína que está envolvida no controle do ciclo celular nos estigmas/estiletes de N. tabacum. / The biology of plant sexual reproduction is a research field of great importance, since most of the food consumed by humans is composed of plant reproductive parts (fruits and seeds), originated by the development of fertilized pistil parts. In Nicotiana tabacum, it was identified a stigma/style-specific gene, SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), which acts in the inhibition of cell proliferation (DePaoli et al., 2011). Through pull down assays, the interaction of the SCI1 protein with a cyclin-dependent protein kinase (CDK) was verified (Strini, unpublished). This work aimed the characterization of this new CDK, orthologous to the Arabidopsis CDKG;2. The N. tabacum corresponding sequence (NtCDKG;2) was PCR amplified, from stigmas/styles cDNAs, cloned and sequenced, which allowed the confirmation of its identity. The NtCDKG;2 expression was analyzed in the different vegetative and reproductive organs, by qRT-PCR, evidentiating an ubiquitous expression pattern. Studying the expression pattern of this gene in stigmas/styles of the twelve stages of N. tabacum flower development, it was observed that NtCDKG;2 is more expressed at the later developmental stages towards anthesis, indicating an important function of its protein in the end of pistil development. NtCDKG;2 expression analyses in stigmas/styles of N. tabacum plants with an enhanced auxin production in the pistil suggest that NtCDKG;2 is transcriptionally regulated by this hormone. The transient expression of the fusion protein NtCDKG;2-GFP, in N. tabacum leaves, evidentiated the nuclear localization of the studied protein. Stable transgenic plants overexpressing and silencing NtCDKG;2 by RNAi were also generated. Despite the high transcript levels in the plants overexpressing NtCDKG;2 and the low transcript levels in the silencing plants, macroscopic phenotypic alterations were not observed on these plants. Additionally, the expression of the NtCDKG;2 protein, with a histidine tag fused in its N-terminal, was obtained in Escherichia coli BL21(DE3)CodonPlusRP cells. Through studies performed on this work and literature analyses, it is possible to propose that NtCDKG;2 encodes a protein that is involved in the control of cell cycle at the N. tabacum stigmas/styles.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-22042013-141248 |
| Date | 18 October 2012 |
| Creators | Lubini, Greice |
| Contributors | Goldman, Maria Helena de Souza |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
Page generated in 0.0022 seconds