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Previous issue date: 2016-08-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A leishmaniose visceral (LV) é uma doença causada por protozoários parasitas intracelulares da espécie Leishmania infantum chagasi nas Américas. Esses parasitos possuem forte tropismo por órgãos viscerais, especialmente baço, fígado e medula óssea, onde se proliferam e provocam lesões podendo ser letal caso não sejam tratadas. O parasito possui moléculas consideradas fatores de virulência que vem sendo intensamente investigadas. Entre elas destacamos as proteínas ligante de heparina (PLH), glicoproteínas relacionadas em diversos trabalhos na literatura com o processo de adesão e internalização do parasito à célula hospedeira. Nesse trabalho utilizamos a PLH de L. infantum chagasi (PLHLc) em experimentos de imunização de camundongos BALB/c para avaliar a proteção conferida a esses animais após desafio com as formas promastigotas do parasito. Foram avaliadas a carga de parasitos no baço e no fígado, produção de citocinas (IFN- , TNF, IL-2, IL-17, IL-6, IL-10 e IL-4) e de óxido nítrico (NO) após imunização com PLHLc isolada ou associada ao Adjuvante Incompleto de Freund (AIF) e Adjuvante Saponina (SAP), quatro semana após o desafio. Os camundongos foram imunizados por via intraperitoneal ou subcutânea, sendo submetidos a duas doses de reforço utilizando o mesmo protocolo da primeira imunização. Quinze dias após a última dose os camundongos foram infectados com 1 x 10 7 promastigotas de L. infantum chagasi em fase final logarítmica de crescimento. Quatro semanas após a infecção os animais foram eutanasiados e o baço e o fígado foram coletados para ensaio da quantificação da carga parasitária e avaliação da produção de citocinas e NO por citometria de fluxo e pelo método de Griess, respectivamente. Nossos resultados mostraram que o grupo imunizado apenas com PLHLc não apresentou redução da carga parasitária e os esplenócitos estimulados in vitro com antígeno particulado de L. infantum chagasi (AgLc) produziram citocinas IL-6 e IL-17, ambas de padrão de resposta imune Th17 e a citocina IL-10. O grupo imunizado com PLHLc + AIF apresentou redução da carga de parasitos apenas no baço e produziram citocinas IFN- e IL-2 (Th1), IL-6 e IL-17 (Th17) e IL-10. O grupo imunizado com PLHLc + SAP apresentou redução da carga parasitária no baço e no fígado. Os esplenócitos desse grupo estimulados in vitro com AgLc produziram maiores médias de citocinas de padrão de resposta imune Th1 e Th17 e a citocina reguladora IL-10 comparado com os grupos anteriores. Em relação a produção de NO por esplenócitos estimulados in vitro com AgLc níveis basais foram detectados pelo método de Griess em todos os grupos avaliados. Os resultados alcançados nos mostra que a PLHLc associada ao adjuvante Saponina representa uma forte candidata a vacina contra LV e nos direciona para uma nova etapa de investigação, a proteção conferida pela PLHLc recombinante. / Visceral leishmaniasis (VL) is a disease caused by the protozoan intracellular parasite Leishmania infantum chagasi specie in the Americas. These parasites exhibit a strong tendency to invade visceral organs, especially the spleen, liver and bone marrow, where they proliferate and cause injuries and can be lethal if not treated. The parasite exhibit molecules considered as virulence factors that have been intensively searched. Among then we highlight the heparin-binding proteins (HBP), glycoproteins related in several studies in the literature with the process of adhesion and internalization of the parasite to the host cell. In this work, we used L. infantum chagasi HBP (HBPLc) in immunization experiments using BALB/c mice to evaluate the protection given to the animals after challenge with promastigote forms of the parasite. Were evaluate the parasite load in the spleen and liver, cytokine production (IFN- , TNF, IL-2, IL-17, IL-6, IL-10 e IL-4) and nitric oxide (NO) after immunization with isolated HBPLc or associated with Incomplete Freund’s Adjvant (IFA) and Saponin Adjuvant (SAP), four weeks after challenge. The mice were immunized by intraperitoneal or subcutaneous route and submitted two times to booster doses using the same protocol of the first immunization. Fifteen days after the last dose the mice were infected with 1 x 10 7 L. infantum chagasi promastigotes end logarithmic phase of growth. Four weeks after infection the animals were euthanized and spleen and liver were collected for assay quantification of the parasite load and evaluation of the cytokine and NO production by flow cytometry and by Griess method, respectively. Our results showed that the group immunized with only HBPLc showed no reduction in parasite load and spleen cells stimulated in vitro with crude extract of L. infantum chagasi (AgLc) produced cytokines IL-6 and IL-17, both standard immune response Th17 and IL-10 cytokine. The group immunized with HBPLc + IFA decreased the parasite load only in the spleen and produced cytokines IFN- and IL-2 (Th1), IL-6 and IL-17 (Th17) and IL-10 cytokine. The group immunized with HBPLc + SAP decreased the parasite load in the spleen and liver. The spleen cells this group in vitro stimulated with AgLc generated pattern cytokines of Th1 and Th17 and regulatory cytokine IL-10 compared to previous groups. About NO production by spleen cells stimulated in vitro with AgLc baseline levels were detected by Griess method in all groups evaluated. The results achieved shows that the HBPLc associated with Saponin adjuvant is a strong candidate against VL vaccine and directs us to a new stage of research, the protection given by recombinant HBPLc.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:123456789/9239 |
| Date | 22 August 2016 |
| Creators | Emerick, Sabrina de Oliveira |
| Contributors | Oliveira, Leandro Licursi de, Silva, Eduardo de Almeida Marques da |
| Publisher | Universidade Federal de Viçosa |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFV, instname:Universidade Federal de Viçosa, instacron:UFV |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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