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Previous issue date: 2009 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A imunização genética com um DNA plasmidial, contendo o gene que
codifica a proteína 2 da superfície de amastigotas (ASP-2), é capaz de proteger
parte dos camundongos altamente suscetíveis A/Sn contra uma infecção letal
pelo Trypanosoma cruzi. Com base neste resultado, a hipótese central desta
tese foi a de que se poderia melhorar racionalmente a eficácia da vacinação
contra a infecção experimental pelo T. cruzi, utilizando diferentes formulações
vacinais e/ou esquemas de vacinações. Para tal, empregaram-se protocolos de
imunização e reforço homólogo ou heterólogo, usando DNA plasmidial,
proteínas recombinantes, e vírus recombinantes da ASP-2 de T. cruzi.
Inicialmente, testou-se se o reforço heterólogo com a proteína ASP-2
recombinante aumentava a eficácia da vacinação com o DNA plasmidial
(pIgSPCl.9). Este protocolo não se mostrou mais eficaz, mas abriu a
possibilidade de que a imunização com a proteína ASP-2 recombinante
pudesse ser utilizada como um protocolo vacinal alternativo. Com esta
abordagem, descreveu-se que a administração de 3 doses de uma proteína
recombinante (GST-P4P7), representando os aminoácidos 261-500 da ASP-2
em fusão com a glutationa S-transferase, na presença dos adjuvantes alum e
CpG ODN 1826, era capaz de induzir altos níveis de proteção. Neste modelo
experimental, observou-se que a imunidade protetora foi de longa duração e
dependente dos linfócitos CD8 específicos para o epítopo imunodominante
TEWETGQI. Determinou-se também que o adjuvante CpG ODN 1826
melhorou a eficácia da imunidade protetora, e que linfócitos T CD4 específicos
são importantes para a indução dos linfócitos CD8 protetores.
Como o protocolo de vacinação com a proteína recombinante GST-P4P7
exigia o uso de três doses, testou-se então a possibilidade de que um
adenovírus recombinante, expressando a ASP-2 (AdASP-2), pudesse ser
utilizado num protocolo de imunização e reforço homólogo ou heterólogo
(somente duas doses). Na comparação dos protocolos de vacinação
homólogos ou heterólogos com pIgSPCl.9 e AdASP-2, observou-se que, nos
animais A/Sn, tanto a imunização homóloga quanto a heteróloga, usando o
AdASP-2, proporcionaram um alto grau de imunidade protetora contra a
infecção pelo T. cruzi. Os estudos utilizando o protocolo heterólogo (pIgSPCl.9
seguido por AdASP-2), que protege 80-100% dos camundongos, mostraram
que a imunidade era de longa duração e dependente dos linfócitos T CD4 e
CD8. Esta imunidade protetora se correlacionou com a atividade citotóxica
específica in vivo, antes do desafio com o T. cruzi. Com base nestes
resultados, analisou-se a imunidade protetora após a vacinação heteróloga em
camundongos com deficiência de um importante mediador da citotoxicidade, a
perforina. Os animais deficientes (KO) da expressão de perforina vacinados se
mostraram suscetíveis à infecção experimental. Uma análise da resposta
imune celular destes camundongos mostrou que eles apresentavam uma
menor produção de IFN-γ por esplenócitos re-estimulados in vitro, na presença
do antígeno recombinante. Na análise dos linfócitos T CD8 específicos
observou-se que havia: i) uma expansão numérica normal; ii) uma redução
numérica significativa dos linfócitos multifuncionais, capazes de expressar
simultaneamente IFN-γ/CD107a e IFN-γ/TNF-α.; iii) baixa citotoxicidade in vivo;
iv) baixa expressão de CD44 e de KLRG-1.
Por fim, para definir a importância relativa do IFN-γ e da citotoxicidade
na proteção contra a infecção pelo T. cruzi após a vacinação heteróloga,
camundongos IFN-γ KO foram imunizados com pIgSPCl.9 seguido por AdASP-
2. Estes animais apresentaram um alto grau de citotoxicidade in vivo, mas
nenhuma imunidade protetora detectável.
Em resumo, ao longo deste trabalho obtiveram-se evidências que
confirmam a hipótese inicial de que, utilizando diferentes formulações vacinais
e/ou esquemas de vacinações, se poderia melhorar racionalmente a eficácia da
vacinação contra a infecção experimental pelo T. cruzi. Pela utilização de
depleções in vivo e de animais geneticamente deficientes, definiu-se a
importância dos linfócitos T CD4 e CD8, da perforina e do IFN-γ na imunidade
gerada pela vacinação com a ASP-2 de T. cruzi. Acredita-se que os dados
obtidos no decorrer desta tese serviram para: i) uma melhor compreensão dos
mecanismos imunológicos de resistência à infecção pelo T. cruzi e dos seus
antígenos alvos; ii) o desenvolvimento de vacinas recombinantes contra
infecções por protozoários intracelulares em geral e, especificamente, contra a
doença de Chagas; iii) o desenvolvimento de vacinas recombinantes capazes
de induzir uma potente resposta imune mediada por linfócitos T. / Genetic immunization with plasmidial DNA containing the gene encoding
the amastigote surface protein 2 (ASP-2) protects part of the highly susceptible
A/Sn mice against a lethal challenge with Trypanosoma cruzi. Based on these
results, in this thesis, we tested the hypothesis that the efficacy of the
vaccination against T. cruzi experimental infection could be rationally improved
by the use of different vaccine formulations and/or vaccinations strategies. For
that purpose, we employed homologous or heterologous priming and boosting
strategies, with plasmidial DNA, recombinant proteins, and adenovirus
expressing T. cruzi ASP-2. Initially, we tested whether boosting with a
recombinant protein of ASP-2 could improve the efficacy of the priming
vaccination with plasmidial DNA (pIgSPCl.9). This protocol was not more
efficient, but opened the possibility that the immunization with the recombinant
protein could be used as an alternative vaccine strategy. Using this approach,
we described that the administration of 3 doses of a recombinant protein
representing the amino acids 261-500 of ASP-2 in fusion o the gluthatione Stransferase
(GST-P4P7), in the presence of the adjuvants alum and CpG ODN
1826, was capable of eliciting high levels of protective immunity. In this
experimental model, protective immunity was: i) long-lasting; and ii) dependent
on the effector CD8 T lymphocytes specific for the immunodominant epitope
TEWETGQI. We also established that the adjuvant CpG ODN 1826 improved
the efficacy of protective immunity, and that CD4 T lymphocytes were important
for the induction of protective CD8 T cells.
Because the vaccination strategy employing the recombinant protein
GST-P4P7 required 3 doses, we tested the possibility that a recombinant
adenovirus expressing ASP-2 (AdASP-2) could be used in a homologous or
heterologous priming and boosting protocol with two doses only. By comparing
homologous or heterologous priming and boosting with pIgSPCl.9 and AdASP-
2, we found that homologous or heterologous immunizations with AdASP-2 led
to a high degree of protective immunity against T. cruzi infection, in highly
susceptible A/Sn mice. Follow up studies using the heterologous priming and
boosting strategy (pIgSPCl.9 followed by AdASP-2), which protects 80-100% of
the mice, showed that protective immunity was long-lived and dependent on the
activation of CD4 or CD8 T cells. Protective immunity correlated with antigenspecific
in vivo cytotoxic activity prior to the challenge with T. cruzi. Based on
this observation, we evaluated the protective immunity following the
heterologous vaccination in mice genetically deficient for an important mediator
of cytotoxicity, perforin. Vaccinated perforin knock-out (KO) mice were
extremely susceptible to the experimental infection. The analyses of the
immune response of these mice showed that their splenocytes produced less
IFN-γ when re-stimulated in vitro with recombinant antigen. Analysis of specific
CD8 T lymphocytes showed: i) a normal numeric expansion; ii) a significantly
lower frequency of polyfunctional cells expressing simultaneously IFN-γ/CD107a
or IFN-γ/TNF-α.; iii) lower in vivo cytotoxicity; iv) lower expression of CD44 and
KLRG-1.
Finally, to define the relative importance of IFN-γ and cytotoxic T
lymphocytes in the protection against T. cruzi infection following heterologous
vaccination, IFN-γ KO mice were immunized with pIgSPCl.9 followed by
AdASP-2. These mice developed a high level of in vivo cytotoxicity, but no
detectable protective immunity.
In summary, during this work we gathered evidences that confirmed our
initial hypothesis that we could rationally improve the efficacy of vaccination
against T. cruzi experimental infection using different vaccine formulations
and/or vaccination strategies. Using in vivo depletions and KO mice, we defined
the importance of CD4 cells, CD8 cells, perforin and IFN-γ during immunity
generated by vaccination with ASP-2 of T. cruzi. We believe that our findings
will provide: i) a better understanding of the immunologic mechanisms and the
target antigens during the resistance to T. cruzi infection; ii) to aid the
development of recombinant vaccines against intra-cellular parasitic protozoan
infections in general and Chagas’ disease, specifically; iii) to aid the
development of recombinant vaccines capable of eliciting potent immune
response mediated by T lymphocytes. / BV UNIFESP: Teses e dissertações
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unifesp.br:11600/10404 |
| Date | January 2009 |
| Creators | Alencar, Bruna Cunha Gondim de [UNIFESP] |
| Contributors | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rodrigues, Mauricio Martins [UNIFESP] |
| Publisher | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 150 f. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNIFESP, instname:Universidade Federal de São Paulo, instacron:UNIFESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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