Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T03:49:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2014 / Resumo: A via de sinalização da Calcineurina (Cn), uma fosfatase dependente de cálcio, desempenha papel chave no desenvolvimento, na hipertrofia e no remodelamento patológico do coração. A Calcineurina é negativamente regulada pelas Calsarcinas (CS), uma família de proteínas específicas do músculo estriado, que interagem diretamente com Cn. No entanto, os mecanismos moleculares de inibição de Cn por CS permanecem obscuros. Compreender a estrutura do complexo Cn:CS é fundamental para desvendar esse mecanismo de regulação. Neste trabalho foram combinados ensaios bioquímicos, crosslinking químico acoplado à Espectrometria de Massas (experimentos de MS / MS), análise mutacional e uma estratégia de modelagem computacional para a caracterização estrutural do complexo CnA:CS1 (isto é, constituído pela subunidade A de Cn e a isoforma 1 de CS, ambas murinas). O complexo recombinante foi submetido a crosslinking químico, tripsinizado e analisado por LC-MS/MS. Os dados obtidos foram utilizados em um docking in silico dos modelos de ambos os polipeptídeos, gerando várias poses para o complexo. As poses de menor energia de ligação foram agrupadas de acordo com semelhança estrutural e submetidas à simulação de dinâmica molecular. A superfície de interação identificada em CnA abrangeu as ?-hélices 1, 3 e loops vizinhos, enquanto a superfície correspondente de CS1 compreendeu os loops carboxiterminais das regiões Leu179-Phe185, Phe195-Ser199 e Thr250-Leu264. Notavelmente, a superfície de interação de CnA situa-se muito próxima à folha-? 14, o principal sítio de ligação do motivo PxIxIT do fator de transcrição NFAT, importante efetor da Calcineurina. Experimentos realizados com vários mutantes de CnA (FLAG- CnA) e CS1 (myc -CS1 ) foram utilizados para validar o modelo estrutural do complexo CnA:CS1. Os resíduos Lys40 (CnA) e Glu254 (CS1) foram identificados como críticos para a estabilidade do complexo. O modelo gerado neste estudo apoia a hipótese de que CS1 interage com um sítio alostérico para inibir a atividade de CnA / Abstract: Signaling by the calcium-dependent phosphatase calcineurin (Cn) plays key roles in regulating cardiac development, hypertrophy, and pathological remodeling. Cn binds to and is negatively regulated by calsarcins (CS), a family of muscle-specific proteins. However, the molecular mechanisms involved in the inhibition of Cn by CS remain unclear. Understanding the architecture and structure of Cn-CS complex is critical to unravel the regulation of Cn by CS. Here we combined biochemical assays, chemical crosslinking coupled to mass spectrometry experiments (MS/MS), mutational analysis and a modeling strategy for structural characterization of CnA-CS1 assembly. The MS/MS data obtained from the cross-linked peptides of both proteins were used to guide an in silico docking of their polypeptide models. The protein complex models with the smallest estimated binding energy were clustered according to structural similarity and submitted to molecular dynamics simulation. The interacting surface of CnA was mapped in a pocket between the 1st and 3rd ?-helixes and surrounding loops, while the corresponding surface of CS1 was mapped to the carboxyterminal loops within the Leu179-Phe185, Phe195-Ser199 and Thr250-Leu264 regions. Notably, the region of CnA that interacts with CS1 was found to be located in close proximity, but not coincident, to the ?-sheet 14, the main binding site for the PVIVIT sequence of NFAT. Experiments performed with several CnA (FLAG-CnA) and CS1 (myc-CS1) mutants were used to validate the structural model of the CnA-CS1 assembly. The Lys40 (CnA) and Glu254 (CS1) residues were identified as critical for the complex stability. The model that emerges from this study supports the notion that CS1 interacts with an allosteric site to inhibit the activity of CnA / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unicamp.br:REPOSIP/314411 |
| Date | 26 August 2018 |
| Creators | Koscky Paier, Carlos Roberto, 1983- |
| Contributors | UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, Franchini, Kleber Gomes, 1961-, Leme, Adriana Franco Paes, Kobarg, Jörg, Trivella, Daniela Barretto Barbosa, Oliveira, Juliana Ferreira de |
| Publisher | [s.n.], Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia, Programa de Pós-Graduação em Biologia Funcional e Molecular |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 199 p. : il., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da Unicamp, instname:Universidade Estadual de Campinas, instacron:UNICAMP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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