INTRODUÇÃO: O transplante de intestino (TI) estabeleceu-se como tratamento para pacientes com falência intestinal e complicações da nutrição parenteral. Entretanto, sepse continua sendo a principal causa de mortalidade. A lesão causada pela isquemia seguida de reperfusão (LIR) é apontada como um dos fatores de ruptura da barreira mucosa intestinal, com consequente translocação bacteriana e sepse, seja precocemente, por lesão epitelial direta, seja mais tardiamente pela sua associação com o desenvolvimento da rejeição celular aguda. Criou-se um modelo de TI em porcos jovens com a finalidade de estudar a LIR e seus efeitos no epitélio intestinal. MÉTODOS: Para a padronização do modelo, foram realizados 25 procedimentos, tendo sido testados os tamanhos dos animais, as soluções de preservação, o tipo de drenagem venosa, o tipo de reconstrução intestinal e o tempo de duração do experimento. Na pesquisa propriamente dita, 20 porcos jovens foram submetidos a TI ortotópico. Dois grupos foram determinados conforme o tempo de isquemia fria a que foi submetido o intestino: grupo 1 (n=12) 90 minutos (min) e grupo 2 (n=8) 180 min. O procedimento foi realizado sob técnica asséptica e as anastomoses vasculares realizadas entre a aorta do doador e a aorta infra-renal do receptor e a veia porta do doador e a veia cava inferior do receptor. O trânsito intestinal foi reconstruído através de anastomoses entre o jejuno proximal do doador e do receptor e o íleo terminal do doador e do receptor. A solução de preservação utilizada foi Euro Collins. Não foi administrada medicação imunossupressora, exceto pela metilprednisolona (20mg/kg) no momento da reperfusão. Fragmentos de intestino foram obtidos: 1 no momento da laparotomia do doador, o fragmento basal, considerado controle, 2 30 min após a reperfusão e 3 3 dias após o transplante. Os fragmentos assim obtidos foram submetidos a: 1 análise histológica com coloração de hematoxilina-eosina (HE), 2 análise imunoistoquímica para a detecção de infiltração da mucosa por neutrófilos (marcados pelos grânulos ricos em mieloperoxidase MPO), 3 análise histoquímica para quantificação de células epiteliais em apoptose pelo método TUNEL, 4 análise da expressão dos genes da endotelina-1 (ET-1) e da interleucina-6 (IL-6), do gene antiapoptótico Bcl-XL e do gene pró-apoptótico Bak. A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste de Mann-Whitney na comparação entre os grupos e, na análise da evolução temporal da LIR em cada grupo, o teste de Friedman seguido do teste post hoc de Dunn quando detectada diferença estatisticamente significante. RESULTADOS: Não foram encontradas diferenças entre os grupos quanto às alterações histológicas estudadas. O grau de infiltração da mucosa por neutrófilos elevou-se significantemente nos dois grupos 30 min após perfusão, tendo persistido elevado 3 dias após o TI somente no grupo 2. O número de células epiteliais em apoptose detectadas pelo método TUNEL sofreu incremento significante apenas no grupo 1, 3 dias após o procedimento. As duas citocinas estudadas, IL-6 e ET-1 mostraram elevação significante 30 minutos após a reperfusão, tendo retornado aos níveis basais 3 dias após a cirurgia em ambos os grupos. Detectou-se redução significante da expressão do Bcl-XL somente no grupo 1, 3 dias após o TI. CONCLUSÕES: As citocinas estudadas estão envolvidas no processo de LIR nas fases iniciais do TI. Ocorre diminuição da expressão de gene anti-apoptótico e aumento do número de células em processo de morte celular de maneira mais intensa no grupo submetido a menor tempo de isquemia / INTRODUCTION: Intestinal transplantation (ITx) has become an accepted mode of treatment of intestinal failure patients who develop parenteral nutrition-related complications. Overall outcomes have dramatically improved but sepsis remains the leading cause of mortality. Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been related to the development of sepsis due either to direct mucosal damage or to increased risk of acute cellular rejection. An experimental ITx model has been idealized in order to better characterize IRI-associated mucosal damage. METHOD: 25 procedures involving 75 outbred pigs were necessary to standardize the procedure. Weight of the animals, venous drainage, intestinal transit reconstruction as well as the time period the animals should be maintained alive were evaluated. Orthotopic ITx was performed in 20 hybrid pigs. Two groups were assigned according to cold ischemia time (CI): group 1 (n=12) 90 minutes (min), group 2 (n=8) 180 min. The procedure was performed under aseptic technique and portal drainage was adopted as standard. Intestinal transit reconstruction involved the performance of termino-terminal anastomosis between donor and recipient jejunum and donor and recipient terminal ileum. Euro-Collins was used as preservation solution. 20mg/kg of metilprednisolone was administered at reperfusion and no other immunosuppressive drug has been employed. Specimens were collected from the donor at laparotomy, and from the receptor, 30 min, and 3 days after reperfusion. Mucosal damage was assigned by histological evaluation with hematoxylin-eosin dye. Neutrophilic infiltration was quantified using myeloperoxidase (MPO) immunohistochemical assay and epithelial cell apoptosis was also assigned by means of TUNEL assay. Molecular biology involved the quantification of the expression of the IL-6, ET-1, Bak, and Bcl-XL genes. RESULTS: No statistical difference was detected between the groups as far as plain histological evaluation is regarded. Neutrophilic infiltration increased in a similar fashion in both groups, but lasted longer in group 2. Apoptosis detected by TUNEL showed significant increase in group 1, 3 days after surgery. Anti-apoptotic gene Bcl-XL had its expression decreased in group 1, in 3 days as well. Endothelin-1 and IL-6 genes expression increased 30 min after the procedure and had already returned to baseline 3 d after surgery. CONCLUSION: IL-6 and ET-1 are involved precociously in the development of intestinal IRI. Neutrophilic infiltration lasted longer in the group submitted to longer CI. Although there were no significant differences between the groups, significant increase in the number of apoptotic epithelial cells 3 days after reperfusion could be detected in animals
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-24032011-144654 |
| Date | 15 February 2011 |
| Creators | Pinho-Apezzato, Maria Lúcia de |
| Contributors | Maksoud Filho, João Gilberto |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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