Einleitung
Defekte des hyalinen artikulären Knorpels führen häufig zur Ausbildung einer Arthrose, weshalb deren Therapie überaus wichtig ist. Ein vielversprechender Ansatz dafür ist das Tissue Engineering (T.E.) eines zonal aufgebauten Knorpelkonstrukts. Für die Verbindung eines solchen Konstrukts mit dem subchondralen Knochen des nativen Gewebes ist eine untere mineralisierte Knorpelzone von besonderer Bedeutung. Bisher ist es nicht gelungen die Mineralisation in vivo ohne Bildung von Knochengewebe und ohne längere In-vitro-Vorkultivierung auf die untere Zone zu beschränken. Um eine ausreichende Produktion von Extrazellularmatrix (EZM) bis zur Defektfüllung gewährleisten zu können ist die Formstabilität eines solchen Konstrukts ebenfalls wichtig.
Ziele der Untersuchung
Ziel dieser Studie war es, ein formstabiles bizonales Knorpelersatzgewebe mit einer oberen hyalinartigen Zone und einer unteren hypertrophen Knorpelzone zu generieren, bei dem sich die Mineralisation in vitro und in vivo auf die untere Zone beschränkt und die Bildung von Knochengewebe verhindert wird. Außerdem sollte die zonale Entwicklung so weit wie möglich in vivo ohne längere vorherige In-vitro-Kultivierung von statten gehen.
Tiere, Material und Methoden
Für die Herstellung von Knorpel-T.E.-Konstrukten wurde das Bioprinting von porzinen artikulären Chondrozyten (pACs) und porzinen Mesenchymalen Stromazellen (pMSC) etabliert (pAC: n=3, pMSC: n=4). Anschließend wurden nicht-zonale und zonale gedruckte Konstrukte mit gegossenen Konstrukten verglichen. Als Trägermaterial wurde starPEG/Heparin- (7,5x106 Zellen/ml, 50 % abbaubar, gedruckt: 19 μl, gegossen: 30μl) bzw. Fibrin-Hydrogel (7,5x106 Zellen/ml, gegossen: 30 μl) verwendet (nicht-zonal: n=2, zonal: n=3 bzw. 6). Als Alternative zum Einsatz eines Hydrogels für die untere Zone wurde die Herstellung Hydrogel-freier selbstkondensierter pMSC-Knorpelscheiben in der Transwellkultur (TWK) etabliert und ihr Potential zur hypertrophen Differenzierung untersucht. Anschließend wurde die In-vitro-Mineralisationskapazität der Knorpelscheiben (0,5x106 pMSC) mittels 5 verschiedenen Mineralisationsmedien über 4, 6 und 8 Wochen hinsichtlich der Mineralablagerung und des Erhalts der knorpeligen EZM getestet (n=6). Das Medium mit den besten Ergebnissen wurde für die In-vitro-Kultivierung der unteren Zone der zonalen Konstrukte verwendet. Zur Etablierung der In-vitro-Herstellung der oberen Zone wurden pAC-haltigen starPEG-Heparin- und Fibrin-Hydrogele in konventioneller und TW-Kultur über 6 Wochen chondrogen kultiviert (n=8/9).
Zusammenfassung
Zonale Konstrukte, bestehend aus einer unteren Knorpelscheibe (0,5x106 pMSC) und einem oberen pAC-haltigen Hydrogel (45μl, 20x106 pACs) aus gegossenem starPEG/Heparin (100 % abbaubar) bzw. Fibrin reiften anschließend über 6 Wochen sowohl unter In-vitro-Bedingungen in der TWK als auch nach subkutaner Implantation in 9 Mäusen (CB17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl) aus (n=9). Dabei wurde die Formstabilität, die Ablagerung von Kollagen Typ II, die Hypertrophie, der Mineralisationsgrad sowie die Beschränkung der Mineralisation auf die untere Zone mittels Vermessungen der Form, histologischen Färbungen und μCT-Scans untersucht. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Mann-Whitney-U Test mit anschließender Bonferroni-Korrektur (SPSS 22.0.0.0). Als statistisch signifikant wurden dabei Signifikanzniveaus von p ≤ 0,05 angesehen.
Ergebnisse
Mittels Bioprinting von pMSC und pACs in starPEG/Heparin konnten stabile Hydrogele hergestellt werden. Das Bioprinting von starPEG/Heparin-Hydrogel zeigte allerdings keinen Vorteil gegenüber dem Gießen. Sowohl die gedruckten als auch gegossenen zonalen und nicht-zonalen Konstrukte zeigten eine mangelhafte Kollagen Typ II-Ablagerung der pMSC in starPEG/Heparin-Hydrogel. Fibrin-Hydrogel förderte die Kollagen Typ II-Ablagerung der pMSC, zeigte allerdings eine Kontraktion während der Kultivierung. Für die Herstellung von selbstkondensierten Knorpelscheiben aus pMSC als Alternative für die untere Zone hat sich das Waschen der Zellen in Phosphat- gepufferter Salzlösung (PBS) nach Monolayerkultur, die Verwendung von 0,5x106Zellen pro Transwell-Insert gelöst in PBS, die Kultivierung in 0,5 ml chondrogenem Medium (CHO) ohne TGF- β1 über die ersten 3 Tage im unteren Kompartiment und anschließender Kultivierung in 2 ml CHO mit 10 ng/ml TGF-β1 für weitere 18 Tage als optimal erwiesen. Mittels Kultivierung der Knorpelscheibe in Hypertrophen Medium konnte ein hoher Proteoglykangehalt und eine homogene Kollagen Typ X-Verteilung innerhalb der Knorpelscheiben erreicht werden. Für die in-vitro- Kultivierung der pAC-haltigen starPEG/Heparin- und Fibrin-Hydrogele wurde in der TWK eine bessere Formstabilität erreicht als in der konventionellen Kultur. Innerhalb der zonalen Konstrukte erreicht das Fibrin-Hydrogel eine bessere Formstabilität sowie eine höhere Mineralisationsstärke der unteren Zone unter In-vitro-Bedingungen als das starPEG/Heparin. Unter In-vivo-Bedingungen blieb die Mineralisation nur bei den starPEG/Heparin-Konstrukten auf die untere Zone beschränk. Die obere Zone der Fibrin-Hydrogele wurde unter In-vivo-Bedingungen vor der Explantation zu einem Großteil abgebaut. Die Mineralisation der unteren Zone sowie die Matrixablagerung in der oberen Zone eines bizonalen Knorpelersatzgewebes ist ohne vorherige In-vitro-Vorkultur unter der Verwendung des starPEG/Heparin-Hydrogels in dieser Arbeit gelungen.
Schlussfolgerung
Die Herstellung eines relativ formstabilen bizonalen Knorpelersatzgewebes mit einer oberen hyalinartigen nicht-mineralisierten und einer unteren mineralisierten Zone ohne Ausbildung von Knochengewebe konnte in dieser Studie erreicht werden. Dabei eignet sich die aus pMSC generierte Knorpelscheibe als untere Zone. Für die obere Zone ist ein pAC-haltiges starPEG/Heparin-Hydrogel aufgrund seiner Eigenschaft, die eine Mineralisation unterbindet, besonders vielversprechend. Fibrin-Hydrogel erwies sich, aufgrund des zu schellen Abbaus in vivo, als ungeeignet für die obere Zone zonaler Konstrukte. Da die Mineralisation der unteren Zone und die Matrixablagerung der oberen Zone nachweislich komplett in vivo stattfinden kann, ist eine vorherige In-vitro-Kultur der zonalen Konstrukte nicht notwendig.:1 Einleitung
2 Literaturübersicht
2.1 Knorpelgewebe
2.1.1 Histogenese von Knorpelgewebe
2.1.2 Aufbau des Knorpelgewebes
2.1.3 Arten von Knorpelgewebe
2.2 Knorpeldefekte im Gelenk
2.2.1 Ursache, Einteilung und Auswirkung von Knorpeldefekten
2.2.2 Therapie von Knorpeldefekten
2.3 Knorpel-Tissue Engineering
2.3.1 Zellen im Knorpel-Tissue-Engineering
2.3.2 Trägermaterialien
2.3.3 Wachstumsfaktoren
2.3.4 Bioprinting
2.3.5 Zonales Knorpel-Tissue-Engineering
2.4 Tiermodell Maus
2.5 Problemstellung und Zielsetzung
2.5.1 Problemstellung
2.5.2 Zielsetzung
3 Tiere, Material und Methoden
3.1 Tiere
3.1.1 Versuchstiere und Tierhaltung
3.1.2 Ektope Konstruktimplantation
3.2 Material
3.3 Methoden
3.3.1 Zellbiologische Methoden
3.3.2 Bestimmung des Mineralisierungsgrades der Konstrukte (Micro-CT)
3.3.3 Bestimmung von Durchmesser und Dicke der Konstrukte
3.3.4 Histologische Untersuchungen
3.3.5 Statistische Auswertung
4 Ergebnisse
4.1 Differenzierungspotential porziner mesenchymaler Vorläuferzellen (pMSC)
4.2 Etablierung des Bioprinting von starPEG/Heparin-Hydrogelen mit porzinen Zellen
4.3 Matrixablagerung von pACs in gedruckten und gegossenen starPEG/Heparin- und gegossenen Fibrin-Hydrogelen
4.4 Chondrogenes Differenzierungspotential von pMSC in gedruckten und gegossenen starPEG/Heparin- und gegossenen Fibrin-Hydrogelen unter verschiedenen Medien- Supplementierungen
4.5 Vergleich gedruckter und gegossener zonaler starPEG/Heparin-Hydrogele mit gegossenen zonalen starPEG/Heparin-Fibrin-Hydrogelen
4.6 Etablierung der Herstellung der unteren Knorpelzone aus pMSC durch Selbstkondensation in Transwellkultur
4.7 In-vitro-Mineralisation von pMSC-haltigen Knorpelscheiben in verschiedenen Mineralisationsmedien
4.8 Etablierung der Herstellung der oberen Knorpelzone: EZM-Ablagerung und Formstabilität
4.9 Charakterisierung von in vitro generierten zonalen Knorpelkonstrukten
4.10 Charakterisierung zonaler starPEG/Heparin- und Fibrin-Konstrukte nach In-vivo-Reifung
5 Diskussion
5.1 Bioprinting nicht-zonaler und zonaler starPEG/Heparin-Hydrogelen mit porzinen Zellen
5.2 Etablierung der Herstellung selbstkondensierender formstabiler Knorpelscheiben aus pMSC
5.3 Effekte verschiedener Mineralisationsmedien auf die Matrixablagerung von pMSC in Knorpelscheiben
5.4 Etablierung der Herstellung und In-vitro-Kultivierung der oberen Knorpelzone: EZM- Ablagerung und Formstabilität
5.5 In-vitro-Vergleich von starPEG/Heparin- und Fibrin-Hydrogel zur Herstellung bizonaler Knorpelkonstrukte
5.6 In-vivo-Vergleich von starPEG/Heparin- und Fibrin-Hydrogel zur Herstellung bizonaler Knorpelkonstrukte
5.7 Fazit und Ausblick
6 Zusammenfassung
7 Summary
8 Literaturverzeichnis
9 Anhang
9.1 Methoden Bioprinting (zusätzliche Informationen)
9.2 Übersicht der Teilversuche zur Etablierung von Knorpelscheiben aus pMSC
9.3 Materialien
10 Danksagung
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:75677 |
| Date | 10 August 2021 |
| Creators | Deubel, Anne-Kathrin |
| Contributors | Universität Leipzig, Universität Heidelberg |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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