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Previous issue date: 2016-09-06 / As leishmanioses são doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania e
estão presentes em 98 países e territórios e possuem incidência anual de 2
milhões de casos. A Leishmania (Viannia) braziliensis (L.V. braziliensis) é uma das
principais espécies causadoras da leishmaniose cutânea (LC) no Brasil. Apesar
disso, ainda não há uma vacina segura e eficaz para ser utilizada em seres
humanos. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi identificar no proteoma
predito de L.V. braziliensis, potenciais epítopos de linfócitos T e avaliá-los por meio
de ensaios imunológicos. No primeiro capítulo, o proteoma predito de L.
braziliensis foi comparado ao de outras espécies e analisado quanto a presença de
epítopos. Nessa etapa foram encontrados epítopos derivados de mais de 8 mil
proteínas conservadas entre diferentes espécies de Leishmania. Os epítopos
foram clusterizados e então utilizados para etapa de docagem molecular com
estruturas de MHC I e MHC II depositadas no Protein Data Bank. A docagem
molecular resultou em epítopos peptídicos de 15 aminoácidos com alta afinidade
de ligação às moléculas de MHC I e MHC II. Os 10 melhores resultados foram
então sintetizados e avaliados, in vitro, quanto à capacidade de estimular a
proliferação de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de indivíduos
com LC após o tratamento (PT). Os resultados indicaram que 50% das moléculas
testadas apresentaram capacidade de estimular, significativamente (p<0,05), a
proliferação celular quando comparado às células de indivíduos saudáveis que não
vivem em região endêmica para LC. No segundo capítulo, os peptídeos foram
avaliados quanto à capacidade de estimular a proliferação de PBMC de indivíduos
com LC em sua fase ativa (AD) e indivíduos moradores de área endêmica para LC
resistentes à infecção (RT). Em paralelo, quantificou-se a expressão do fator de
transcrição T-bet em PBMC de indivíduos PT, e citocinas dos perfis Th1, Th2 e
Th17 foram mensuradas no sobrenadante de cultura das células de indivíduos PT
e AD. Os resultados demonstraram altos níveis de proliferação nas células do
grupo RT para todos os peptídeos testados. Além disso, níveis significativos de Tbet
foram observados em linfócitos T CD4+ e CD8+ após estímulo com seis
peptídeos. Níveis significativos de IFN-γ, TNF e IL-6 foram observados no
sobrenadante das células do grupo PT com quatro dos peptídeos testados. Altos
níveis dessas citocinas também foram encontrados no sobrenadante do grupo AD.
No terceiro capítulo, avaliou-se o efeito dos peptídeos sobre células dendríticas de
medula (BMDC) murinas, produção de citocinas de sobrenadante, e células
dendríticas esplênicas murinas após estímulo com os peptídeos. Verificou-se altos
níveis de MHC II e CD40 em uma subpopulação de BMDC estimuladas com as
moléculas e altos níves de TNF e IL-6 após 48h de estímulo. Para as células
esplênicas, foram observados altos níveis de subpopulações celulares
expressando CD11b+, IL-12p70+, CD205+ e CD11b+ após estímulo com o peptídeo
que teve o melhor resultado in silico. Por fim, os resultados indicam o grande
potencial imunogênico que os epítopos identificados apresentam, o que dá suporte
ao desenvolvimento futuro de abordagens vacinais. / The leishmaniasis are diseases caused by protozoans from the genus
Leishmania which are present in 98 countries and territories, with an annual
incidence of 2 million cases. Among the other species, Leishmania (Viannia)
braziliensis is the main specie implicated with cutaneous leishmaniasis (CL) in
Brazil. Besides that, there is no safe and effective vaccine against leishmaniasis
to be applied in humans. In this context, the aim of this work was to identify in
the predicted proteome of L. braziliensis potential CD4+ and CD8+ T cell
epitopes and evaluate them by immunological assays. In the first chapter, the
predicted proteome of L. braziliensis was compared with other species and
analyzed for the presence of epitopes. In this step, epitopes from more than
8,000 conserved proteins were found among other species of Leishmania. The
epitopes were clustered and then used for the molecular docking with MHC I
and MHC II structures deposited in the Protein Data Bank. This approach
resulted in 15 aminoacids peptide epitopes with high binding affinity for MHC I
and MHC II. The 10 best results were synthesized and evaluated in vitro for
their capacity to stimulate the proliferation of peripheral blood mononuclear cells
(PBMC) of individuals with CL post treatment (PT). The results have shown that
50% of the tested molecules had the capacity to stimulate, significantly
(p<0.05), cell proliferation when compared with cells of healthy individuals living
in non-endemic regions. For the second chapter, the peptides were evaluated
for their capacity to stimulate the proliferation of PBMC from CL individuals with
active disease (AD) and of individuals resistant to infection (RT) living in
endemic region. In parallel, the T-bet transcription factor expression was
quantified in PBMC of PT individuals, and cytokines from the Th1, Th2 and
Th17 profiles were measured in culture supernatant of PT and AD groups. High
levels of cell proliferation in the RT group were demonstrated for all peptides
tested. Moreover, significant levels of T-bet in CD4+ and CD8+ T cells were
verified after stimulation with six peptides. For IFN-γ, TNF and IL-6, significant
levels were detected in the supernatant of cultures from the PT group with four
peptides tested. High levels of these same cytokines were also present in the
supernatant of AD group. In the third chapter, the peptide effects over murine
bone marrow dendritic cells (BMDC), the production of cytokines in the
supernatant and murine spleen dendritic cell subsets were evaluated after
peptide stimuli. High levels of MHC II and CD40 were verified for stimulated
BMDC and high levels of TNF and IL-6 after 48h of stimuli. For spleen cells,
high levels of cells expressing CD11b+, IL-12p70+, CD205+ e CD11b+ were
observed after stimulation with the peptide which showed the best in silico
result. In conclusion, the results indicate the great immunogenic potential of the
identified peptides and support the further development of vaccine approaches
using those molecules.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/18397 |
| Date | 06 September 2016 |
| Creators | SILVA, Rafael de Freitas e |
| Contributors | http://lattes.cnpq.br/9260270756078209, HERNANDES, Valéria Pereira, REZENDE, Antônio Mauro |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco, Programa de Pos Graduacao em Inovacao Terapeutica, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Breton |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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