Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas,
Departamento de Biologia Celular,
Programa de pós-graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-05-21T13:44:10Z
No. of bitstreams: 1
2013_CarolinaBrettasBaptista.pdf: 9474008 bytes, checksum: 13d2a383bdfe08584345d3d55c5e2e79 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-05-24T12:05:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1
2013_CarolinaBrettasBaptista.pdf: 9474008 bytes, checksum: 13d2a383bdfe08584345d3d55c5e2e79 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-24T12:05:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1
2013_CarolinaBrettasBaptista.pdf: 9474008 bytes, checksum: 13d2a383bdfe08584345d3d55c5e2e79 (MD5) / A utilização da biomassa tem se tornado uma atrativa fonte alternativa para a produção de energia. A levedura Saccharomyces cerevisiae é o micro-organismo mais utilizado na indústria de fermentação alcoólica, porém não possui atividade amilolítica. Portanto, a modificação genética dessa levedura vem sendo feita para obteção de novas linhagens amilolíticas. O presente trabalho teve como objetivo a construção de um vetor de expressão de
proteínas heterólogas na superfície de S. cerevisiae para coexpressar a enzima
α-amilase de Bacillus subtilis juntamente com a glicoamilase de Aspergillus
awamori na parede celular da levedura. Para ancorar as proteínas de interesse
à parede foi feita a fusão destas com a região C-terminal da α-aglutinina da
própria levedura, contendo a sequencia sinal para adição da âncora de
glicosilfosfatidilinositol (GPI) e as proteínas expressas na linhagem MFL.
Utilizou-se três formas diferentes de glicoamilase, uma contendo o gene
completo (gla1), outra apenas com o domínio catalítico e a região altamente O-
glicosilada (gla2) e uma última com domínio catalítico e parte da região O-
glicosilada (gla3). Os testes de atividade mostraram que a enzima α-amilase
aderiu à parede celular, porém a maior parte da proteína produzida ainda era
secretada para fora da célula. As maiores atividades encontradas para as
construções contendo α-amilase fusionada à porção C-terminal da α-aglutinina
foi de 0,99 ± 0,02 U/mL e 89,43 ± 5,27 U/mL, associada à célula e no
sobrenadante, respectivamente. A secreção da α-amilase para o meio de cultura apresentou grande aumento quando fusionada a outra proteína. A atividade observada para glicoamilase também foi maior no sobrenadante de cultura. As três diferentes formas de glicoamilase fusionadas à α-aglutinina não apresentaram diferenças significativas de expressão entre si. A análise do perfil secretório mostrou que as enzimas fusionadas encontradas no sobrenadante de cultura apresentam a mesma massa molecular da enzima secretada sem
fusão alguma. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Biomass has become an attractive alternative source for energy
production. The yeast Saccharomyces cerevisiae is the most used
microorganism in industrial fermentation, however it doesn’t have amylolytic
activity. Therefore, molecular engineering of this yeast have been done to
obtain new amylolytic strains. The aim of this work was to construct a vector for
expression of heterologous proteins on the cell surface of S. cerevisiae to
coexpress the α-amylase from Bacillus subtilis and the glucoamylase of
Aspergillus awamori in the yeast cell wall. To anchor the proteins to the wall, they were fused with the C-terminal region of α-agglutinin containing the signal
sequence for addition of glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor and the protein produced expressed in the MFL strain. We used three different forms of
glucoamylase: one containing the complete gene (gla1), another with only the
catalytic domain and the highly-glycosylated region (gla2) and the last one with
a catalytic domain and part of the O-glycosylated region (gla3). The activity
tests showed that the enzyme α-amylase was attached to the cell wall, but most
of the produced protein was secreted to the culture medium. The highest
activities found for the constructs containing α-amylase fused to the C-terminal
region of α-agglutinin was 0,99 ± 0,02 U/mL and 89,43 ± 5,27 U/mL, to pellet
and supernatant, respectively. The secretion of α-amylase protein was greatly increased when fused to another protein. The activity found for glucoamylase was also higher in the culture supernatant. The three different forms of glucoamylase fused to C-terminal region of α-agglutinin showed no significant differences in expression among them. The secretory analysis showed that
merged enzymes found in the culture’s supernatant presented the same
molecular mass as the enzyme secreted without any fusion.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/13195 |
| Date | 22 February 2013 |
| Creators | Baptista, Carolina Brêttas |
| Contributors | Torres, Fernando Araripe Gonçalves, Moraes, Lídia Maria Pepe de |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0033 seconds