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Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A Leishmania é um parasito intracelular obrigatório que vive e se multiplic adentro dos vacúolos parasitóforos em macrófagos no hospedeiro vertebrado. Apesar dos vacúolos induzidos por diferentes espécies de Leishmania apresentarem semelhanças bioquímicas, esses compartimentos apresentam diferenças significativas nos seus tamanhos. Os vacúolos parasitóforos induzidos por Leishmania mexicana e Leishmania amazonensis apresentam grandes dimensões e contêm uma grande quantidade de amastigotas, enquanto que os induzidos por Leishmania major e Leishmania donovani são pequenos e com pouco espaço ao redor das amastigotas. Estudos recentes demonstraram que compartimentos induzidos por microrganismos intracelulares são capazes de interagir com a via autofágica e esta pode controlar ou promover o estabelecimento da infecção a depender da natureza do microrganismo. Até o momento, poucos estudos foram realizados para avaliar o papel da autofagia na biogênese e maturação dos vacúolos parasitóforos induzidos por Leishmania. Recentemente, foi demonstrado que em macrófagos de camundongos BALB/c, a indução de autofagia provoca um aumento na carga parasitária de L. amazonensis, no entanto, não é capaz de aumentar a carga parasitária de L. major. Além disso, estudos indicam que vacúolos parasitóforos de L. mexicana adquirem macromoléculas do citoplasma da célula hospedeira por meio de microautofagia. Uma vez que L. amazonensis integra o mesmo complexo que L. mexicana, nossa hipótese é que vacúolos parasitóforos induzidos por L. amazonensis interagem com a via autofágica.Assim, o presente estudo tem como bjetivo verificar e comparar a participação da autofagia na infecção por L. amazonensis ou L. major em macrófagos murinos. Para este fim, avaliamos quanto a características autofágicas, os vacúolos parasitóforos induzidos por L. amazonensis ou L. major em macrófagos de camundongo CBA e analisamos a influência da superexpressão de LC3 sobre a sobrevivência de L. amazonensis ou L. major em macrófagos infectados. Inicialmente, macrófagos de camundongos CBA foram infectados com L. amazonensis ou L. major e incubados com ysoTracker, marcador de compartimentos lisossomais, ou DQ-BSA, marcador de compartimentos degradativos. Além disso, foi avaliada a presença de LAMP, proteína lisossomal, e LC3, proteína específica de autofagossomo, na membrana destes vacúolos. Em seguida, a co- localização dos parasitos com os vacúolos parasitóforos contendo estes marcadores foi quantificada. Nossos resultados demostraram um maior percentual de co-localização tanto do LysoTracker como doDQ-BSAcom parasitos em vacúolos no interior de macrófagos infectados com L. major em comparação com aqueles infectados com L. amazonensis. No entanto, não houve diferença no percentual de co-localização de LAMP com L. major ou L. amazonensis e foi observado um maior percentual de co-localização do LC3 com parasitos em macrófagos infectados com L. amazonensis em comparação com aqueles infectados com L. major. Posteriormente, avaliamos o efeito da superexpressão da LC3 na infecção por L. amazonensis ou L. major. Células de linhagem macrofágica RAW foram transfectadas com o plasmídeo contendo a sequência codificante para a LC3 e infectadas com L. amazonensis ou L. major. Nós observamos uma reduçãono percentual de infecção por L. amazonensis e L. major nas células RAW- pmRFP-LC3 em comparação às controle. Essa diminuição na infecção se deu por inibição da fagocitose de L. amazonensis e L. major pois os parasitos continuam a interagir com a membrana das células RAW-pmRFP-LC3, mas não são internalizadas. Em conjunto, estes dados demonstram que os vacúolos parasitóforos de L. amazonensis e L. major interagem com compartimentos da via autofágica de forma distinta e que a superexpressão de LC3 reduz a fagocitose de L. amazonensis e L. major por células RAW, o que resulta na redução da infecção / Leishmania is an intracellular parasite that lives and multiplies within
parasitophorous vacuoles in macrophages in the vertebrate host. Despite the
fact that vacuoles induced by different species of Leishmania present
biochemical similarities, these compartments have significant differences in
their sizes and composition. The parasitophorous vacuoles induced by
Leishmania mexicana and Leishmania amazonensis are large and contain a
large number of amastigotes, while vacuoles induced by Leishmania major
and Leishmania donovani are small and tight. Recent studies have
demonstrated that depending on the type of intracellular microorganism, the
induced compartments can interact with the autophagic pathway and control
or promote the establishment of infection. To date, few studies have been
conducted to evaluate the role autophagic process plays in the biogenesis
and maturation of parasitophorous vacuoles induced by Leishmania.
Recently, it has been demonstrated that in macrophages of BALB/c mice, the
induction of autophagic causes an increase in parasitic load of L.
amazonensis, but not L. major. Furthermore, other studies indicate that L.
mexicana-induced parasitophorous vacuoles acquire macromolecules from
the cytoplasm of the host cell through microautophagy. Once L. amazonensis
belongs to the same complex that L. mexicana, our hypothesis is that L.
amazonensis-induced parasitophorous vacuoles interact with the autophagic
pathway. Thus, the present study aims to evaluate and compare the role
autophagic process plays in Leishmania infection. We evaluated L.
amazonensis- or L. major-induced parasitophorous vacuoles regarding their
autophagic characteristics and we analyzed the influence of the
overexpression of LC3 on the survival of parasites in infected macrophages.
Initially, macrophages of CBA mice were infected with L. amazonensis or L.
major and incubated with a marker of lysosomal compartments, LysoTracker,
or a marker of degrading compartments, DQ-BSA. In addition, we evaluated
the presence of the lysosomal membrane protein, LAMP-1, and a protein
specific of autophagossomes, LC3 in the membrane of these vacuoles. Then,
the colocalization of parasites with the marker labeled-compartments was
quantified. Our results demonstrated a higher percentage of colocalization of
both LysoTracker and DQ-BSA with parasites in vacuoles within
macrophages infected with L. major in comparison with those infected with L.
amazonensis. However, there was no difference in the percentage of
colocalization of LAMP with L. major or L. amazonensis. We also observed a
higher percentage of LC3-co-localizing with parasites in macrophages
infected with L. amazonensis in comparison with those infected with L. major.
Subsequently, we evaluated the effect of overexpression of LC3 in
macrophages infected with L. amazonensis or L. major. RAW cells were
transfected with the plasmid containing the coding sequence for the LC3
(RAW-pmRFP-LC3) and then were infected with L. amazonensis or L. major
stationary phase promastigotas. A reduction was observed in the percentage
of infected RAW-pmRFP-LC3 cells with L. amazonensis and L. major
compared to control cells. This decrease in the percentage of infected cells is
due to the inhibition of phagocytic ability of RAW-pmRFP-LC3 cells, since the
parasites continue to interact with cell membrane, but is not internalized.
Together, these findings show that L. amazonensis- and L. major-induced
parasitophorous vacuoles interact differently with compartments of the
autophagic pathway and that the overexpression of LC3 reduces
phagocytosis of both L. amazonensis and L. major by RAW-pmRFP-LC3 cells
resulting in the reduction of infection.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/8686 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Dias, Beatriz Rocha Simões |
| Contributors | Guedes, Carlos Eduardo Sampaio, Bonfim, Gilberto Cafezeiro, Santos, Théo de Araujo, Silva, Tânia Regina Marques da, Veras, Patrícia Sampaio Tavares |
| Publisher | Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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