La lectine de Helix pomatia (HPA), extraite de la glande à albumine de l'escargot de Bourgogne et spécifique du résidu GalNAc, appartient à une nouvelle famille de lectine dite de type H. Elle est utilisée depuis plus de vingt ans comme marqueur d'adénocarcinomes (notamment du sein, du colon, du poumon) à fort pouvoir métastatique et donc faible pronostic vital. Son utilisation comme outil de routine en oncologie est, cependant, fortement limitée par son impossibilité à la produire sous forme recombinante. Afin de contourner ces difficultés, des protéines homologues ont été recherchées chez d'autres invertébrés. Deux lectines de type H ont été identifiées chez l'amibe Dictyostelium discoideum (discoidines) et une chez le corail Sinularia lochmodes (SLL-2). Les discoidines sont composées de deux domaines distincts, un domaine C-terminal, spécifique des résidus galactosylés et homologue à HPA et un domaine N-terminal, dit domaine discoidine, de fonction inconnue. Ces travaux de thèse portent, dans un premier temps, sur la poursuite de la caractérisation structurale de la discoidine 1 puis sur la production du domaine N-terminal de la discoidine 2 afin de confirmer la fonction lectine supposée. Dans un second temps, des expériences de microscopie confocale ont montrés que les discoidines ne possédaient pas la capacité d'HPA dans la discrimination des cellules métastatiques par rapport aux non métastatiques. La construction, par mutagenèse, d'une protéine chimérique entre la discoidine 2, très facilement produite dans E. coli, et HPA a alors été entreprise, le but étant de lui apporter la même spécificité qu'HPA. Enfin, la protéine SSL-2 a été clonée et de nombreux essais d'expression sous forme soluble et de purification ont été réalisés en vue de sa caractérisation biochimique et structurale pour sa possibilité d'utilisation comme marqueurs en histopathologie / The lectin of Helix pomatia (HPA), extracted from the albumin gland of the Roman snail and specific for the residue GalNAc, belongs to a new H type lectin family. It is used for twenty years as marker for metastatic adenocarcinoma (in particular breast, colon, lung) associated with poor life prognostic. Nevertheless, its use as routine tool in oncology is highly limited because of its incapability to produce it in a recombinant form. To avoid these difficulties, homologous proteins were searched in others invertebrates. Two H type lectins have been identified in the amiboe Dictyostelium discoideum (discoidins) and one in the coral Sinularia lochmodes (SLL-2). Discoidins are composed of two distinct domains, a C-terminal domain, specific for galactosylated residues and homologuous to HPA and an N-terminal domain, called discoidin domain, with unknown function. This thesis is focused, in a first time, on the continuation of structural characterization of discoidin 1 and on the production of the N-terminal domain of discoidin 2 to confirm the supposed lectin function. In a second time, confocal microscopy experiments showed that discoidins was not able to discriminate metastatic cancer cells to non metastatic ones, as HPA does. The construction, by mutagenesis, of a chimeric protein between discoidin 2, easily produced in E. coli, and HPA, began. The purpose was to give the same specificity as HPA. Last, SLL-2 was cloned and numerous expression assays, in a soluble form, and purification was tried to characterize the protein biochemistrycally and structurally. The aim was to test it as marker in histopathology.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2011GRENV002 |
| Date | 26 January 2011 |
| Creators | Mathieu, Sophie |
| Contributors | Grenoble, Imberty, Anne, Varrot, Annabelle |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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