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Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As leishmanioses formam um grupo de doenças que afetam 350 milhões de pessoas
atualmente, atingindo 88 países em todo o mundo com uma estimativa de 1-2 milhões de
novos casos por ano. O desfecho da infecção causada por Leishmania depende tanto de
fatores do patógeno como do hospedeiro, embora a virulência de Leishmania possa ser
modulada por fatores ambientais e genéticos relacionados aos hospedeiros mamíferos e
vetores, os determinantes moleculares são elementos-chave no estabelecimento da infecção,
ou seja, são os fatores que determinam a virulência. A KMP-11 é uma glicoproteína que está
presente em todos os cinetoplastideos. O presente estudo avaliou a expressão do gene de
KMP-11 de L. amazonensis ao nível de RNA e ao nível de proteína, durante passagens
sucessivas de promastigotas de fase estacionária através de cultivo in vitro, investigando se há
associação entre a sua expressão e a virulência dos parasitos. A avaliação da virulência dos
parasitos mantidos em cultura foi realizada através do acompanhamento da evolução da
infecção experimental murina (modelo in vivo) durante um período de dez semanas,
juntamente com a observação do surgimento de ulceração. A quantificação da carga
parasitária foi realizada nos linfonodos drenantes das lesões, através da através da técnica de
diluição limitante A avaliação também foi realizada pela infecção de macrófagos murinos
(modelo in vitro). Os resultados de medição de pata foram analisados pelo teste não
paramétrico ANOVA 2 fatores, seguido do pós-teste de Bonferroni. Além disso, foi realizada
a determinação da proporção de metacíclicas nos promastigotas de fase estacionária mantidos
em cultura, através da técnica de lise pelo complemento. Nossos resultados mostraram que há
um decréscimo da virulência dos promastigotas de fase estacionária ao longo do número de
passagens, pois os camundongos infectados com as passagens iniciais desenvolveram lesões
maiores do que aqueles com os promastigotas mantidos em cultura por mais tempo. Quanto
ao surgimento de ulcerações, na 10a semana pós-infecção, todos os animais infectados com
promastigotas de 1a passagem apresentavam lesões ulceradas, enquanto que nenhum dos
camundongos infectados com promastigotas de 20a passagem apresentava lesão ulcerada. Na
infecção in vitro, a carga parasitária nos macrófagos testados diminuiu em função do número
das subculturas, o que foi demonstrado através do decréscimo da porcentagem média de
macrófagos infectados e pela quantidade média de amastigotas a cada 100 macrófagos
infectados. A quantificação da carga parasitária foi realizada nos linfonodos drenantes da
lesão dos camundongos infectados, confirmando a diminuição da virulência dos
promastigotas. A quantificação da proporção de promastigotas metacíclicas demonstrou que a
porcentagem diminui ao longo do tempo de subcultivo. A avaliação da expressão de KMP-11
na superfície de promastigotas por citometria de fluxo demonstrou um decréscimo na
expressão da proteína proporcional ao número de subculturas. Verificou-se, portanto, uma
associação entre a expressão da proteína KMP-11 e a virulência de promastigotas de L.
amazonensis. Os resultados dos ensaios de PCR em tempo real demonstraram que não há
diferença estatisticamente significativa na quantidade de transcritos do gene da proteína
KMP-11 entre as passagens analisadas. Entretanto, a perda da virulência associada com a
diminuição da expressão da proteína KMP-11 indica que esta molécula possua uma função na
infectividade dos promastigotas de Leishmania amazonensis, atuando possivelmente como
um fator de virulência. / The leishmaniases are a group of diseases that currently, affects 350 million people reaching
88 countries throughout world with an estimated incidence of 1-2 million new cases per year.
The outcome of the infection caused by Leishmania depends on factors from the pathogen and
from the host. Although Leishmania virulence can be modulated by environmental and
genetic factors related to mammalian hosts and vectors, molecular determinants are key
elements in the establishment of infection and for the determination, of virulence. KMP-11 is
a glycoprotein which is present in all kinetoplastids. This study evaluated the gene expression
of KMP-11 in L. amazonensis at RNA level and at protein level, during successive passages
of in vitro culture, investigating a possible correlation between KMP-11 expression and
virulence of parasites. The evaluation of the virulence of cultured parasites was performed by
monitoring of the progression of the lesions in experimental murine infection (in vivo model)
during ten weeks, along with the emergence of cutaneous ulcers. The quantification of
parasite load was performed on draining lymph nodes using the limiting dilution analysis. The
assessment of parasite virulence was also performed by the infection of murine macrophages
(in vitro model). The paw measurement results were analyzed by nonparametric test ANOVA
2 way, followed by Bonferroni post-test. Furthermore, the metacyclic promastigotes
proportion in stationary growth phase from cultures with different numbers of passages was
evaluated by complement lysis. Our results showed a decrease in promastigotes of stationary
phase virulence that correlated with the increase of the number of passages, as mice infected
with the early passages developed larger lesions than those infected with promastigotes
cultured for longer periods and higher numbers of passages. Concerning the development of
ulcers, at 10th week post-infection, all animals infected with promastigotes of first passage
presented ulcerated lesions, whereas none of the mice infected mice with promastigotes of the
20th passage showed an ulcerated lesion. Analyzing the in vitro infection, the parasite burden
in macrophages decreased with the number of subcultures, as demonstrated by the decrease in
the percentage of infected macrophages and in the number of amastigotes per 100 infected
macrophages. The quantification of parasites in draining lymph nodes of the infected mice
confirmed the decrease in the virulence of promastigotes from cultures with more passages.
The estimation of the metacyclic promastigote proportions showed that the percentages
decline through the time of subculture. The evaluation of KMP-11 expression on the surface
of promastigotes by flow cytometry showed a decrease in protein expression proportional to the number of subcultures. Therefore, there was an association between the expression of KMP-11 protein and the virulence of L. amazonensis promastigotes. The results of real-time
PCR assays showed that there is no statistically significant difference in the amount of gene
transcripts of KMP-11 protein in the analyzed passages. However, the loss of virulence
associated with decreased protein expression of KMP-11 indicates that this molecule may
have a role in promastigotes infectivity of Leishmania amazonensis, possibly acting as a
virulence factor.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/4246 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Santos, Elisangela Madureira dos |
| Contributors | Alves, Carlos Roberto, Amaral, Verônica Figueiredo, Pons, Andréa Henriques, Mendonça, Sergio Coutinho Furtado de |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | Elisângela Madureira dos Santos, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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