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Manuela da Silva Solcà. Uso do PCR...pdf: 11332317 bytes, checksum: 657938584a2c80bcdcc02a52c2d8fa4d (MD5)
Previous issue date: 2012 / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina da Bahia. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / No Brasil, os cães são considerados como o principal reservatório doméstico para Leishmania
infantum (sin. L. chagasi). Desta forma, o diagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC)
deve ser rápido e preciso. Este trabalho visa comparar a performance da reação em cadeia da
polimerase (PCR) em detectar o DNA do parasito em diferentes tecidos para diagnóstico da
LVC. Com este intuito, na primeira parte do estudo, foi padronizado um protocolo de PCR
convencional (cPCR), para detecção do DNA do minicírculo do cinetoplasto (kDNA) de
Leishmania sp., em 45 fragmentos esplênicos caninos. As mesmas amostras foram avaliadas
utilizando-se um protocolo de PCR quantitativa (qPCR) tendo como alvo o gene da
subunidade do RNA ribossomal (SSU rRNA) de Leishmania sp. Também foi comparada a
eficácia do diagnóstico para LVC pelas técnicas moleculares e convencionais como a cultura
e o ELISA. A cPCR apresentou sensibilidade mais elevada para detecção de DNA de
Leishmania sp. (88,9%), comparada à qPCR (83,3%). Possivelmente o melhor desempenho
da cPCR foi devido ao maior números de cópias do kDNA no genoma da Leishmania sp.
Diante dos promissores resultados apresentados pela cPCR tendo o kDNA como alvo, na
segunda parte do estudo foi padronizado um novo protocolo de qPCR com este mesmo alvo,
objetivando-se aumentar a sensibilidade da técnica. Foram selecionados aleatoriamente 61
cães errantes e classificados de acordo com o número de sinais clínicos associados à LVC
apresentados. Todos os cães foram eutanasiados, e durante a necropsia, foram coletados
fragmentos de linfonodo, aspirado esplênico, medula óssea e sangue. Também foram
realizadas culturas esplênicas e ELISA. A qPCR foi empregada para a avalição da taxa de
detecção do DNA do parasito e carga parasitária nos diferentes tecidos. As diferenças entre a
carga parasitária de cada tecido foram avaliadas pelo teste de Friedman (p ≤ 0,05). Para
inclusão dos tecidos nas análises dos resultados de qPCR, foi avaliada a integridade do
material genético de cada amostra. Desta forma, 52 animais apresentaram resultados que
atendiam aos critérios de seleção para baço, sangue e linfonodo, e destes, 24 animais também
atendiam aos critérios para medula óssea. Utilizando-se a qPCR e considerando pelo menos
um dos tecidos avaliados, foi detectado o DNA do parasito em todos os cães. A qPCR
detectou DNA do parasito em 98,1% dos aspirados esplênicos, 80,8% das amostras
sanguíneas, 53,8% dos linfonodos e 41,7% dos aspirados de medula óssea. A carga parasitária
foi melhor detectada nos aspirados esplênicos, em relação ao linfonodo, nos animais
oligossintomáticos e polissintomáticos (p ≤ 0,05). O aspirado esplênico foi o tecido com
maior taxa de detecção do DNA de Leishmania sp. pela qPCR. No entanto, não foi achada
diferença estatística entre a carga parasitária do aspirado esplênico e do sangue. Desta forma,
a amostra sanguínea, por ser a segunda amostra de melhor taxa de detecção, e por necessitar
uma coleta menos invasiva, foi considerada como uma amostra alternativa válida para a
detecção do DNA de Leishmania sp. em cães sintomáticos, utilizando a qPCR. / Because infected dogs are widely considered to be the main domestic reservoir for
Leishmania infantum (syn. L. chagasi) parasites in Brazil, the diagnosis of canine visceral
leishmaniasis (CVL) must be made both accurately and promptly. The aim of the present
study was to compare the performance of the Polymerase Chain Reaction (PCR) to detect
parasite DNA in different clinical sample for CVL diagnosis. For this purpose, in the first
stage of the study, a conventional PCR (cPCR) protocol was standardize to detect the
presence of Leishmania sp. kinetoplast minicircle DNA (kDNA) in 45 canine spleen
fragments. The same samples were evaluated using a quantitative PCR (qPCR) technique
targeting the Leishmania sp. sub-unit of the ribossomal RNA (SSU rRNA) gene. A
comparison was made between the efficacies of these molecular diagnostic techniques and
conventional parasitological and serological methods. The cPCR presented the highest
sensitivity for Leishmania sp. DNA detection (88,9%), when compared to qPCR was (83.3%).
Possibly the cPCR best performance was due to a higher copies number of the kDNA in the
Leishmania sp. genome. Given the promising results presented by the cPCR targeting the
kDNA, a new qPCR protocol with the same target was standardized in the second stage of the
study, aiming increase the technique sensitivity. Sixty-one stray dogs were randomly selected
and classified according to the number of clinical signs of CVL. All dogs were euthanized and
lymph node fragments and splenic, bone marrow and blood aspirates were obtained during
necropsies. ELISA and parasite culture of spleen aspirates were performed to confirm parasite
infection. The qPCR was used to determine the parasite DNA detection rate and the parasite
load in the clinical samples. Differences between parasite loads of each tissue were evaluated
using Friedman test (p ≤ 0.05). In order to include the samples in the qPCR data analysis, the
DNA integrity of each sample was analyzed. This way, 52 dogs fulfilled the selection criteria
for DNA results for spleen, blood and lymph nodes, with 24 of these dogs also fulfilling the
criteria for bone marrow results. Using qPCR, all the 52 dogs showed positivity, considering
at least one of the tissues evaluated. Positivity in qPCR was detected in 98.1%8 of the splenic
aspirates, 80.8% of blood samples, 53.8% of lymph node fragments and 41.7% of bone
marrow samples. Using qPCR, parasite DNA was better detected in splenic aspirates in
comparison with lymph node in both polysymptomatic and oligosymptomatic (p ≤ 0.05) dogs.
Splenic aspirates have shown to be the tissue with highest Leishmania sp. DNA detection rate
using qPCR, however no statistical difference was found between blood and splenic aspirate
to detect. Thus, the blood sample, being the second sample with best DNA detection rate and
requiring a less invasive collection, was considered a valid alternative sample for Leishmania
sp. DNA detection in symptomatic dogs using the qPCR.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/7209 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Solcà, Manuela da Silva |
| Contributors | Fraga, Deborah Bittencourt Mothé, Figueiredo, Fabiano Borges, Silva, Luciano Kalabric, Veras, Patrícia Sampaio Tavares, Veras, Patrícia Sampaio Tavares |
| Publisher | Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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