Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2011. / Submitted by claudia teixeira (claudiadtx@gmail.com) on 2011-06-22T01:12:53Z
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2011_BrunaCândidoGuido.pdf: 2583425 bytes, checksum: 6da0d341ca671f7a9832a6e4581fc86b (MD5) / As leishmanioses, doenças infecciosas causadas por protozoários intracelulares do gênero Leishmania, apresentam manifestações clínicas diversas e tratamento de difícil administração com efeitos colaterais severos. Estas doenças ainda representam um relevante problema de saúde pública que somado a questão do tratamento, refletem a necessidade de se avançar na pesquisa e na busca por novos fármacos. As proteases, enzimas que catalisam a hidrólise de ligações peptídicas de proteínas e cadeias polipeptídicas, desempenham alguns papéis chaves nos parasitos protozoários como na transição do ciclo de vida, invasão do hospedeiro, evasão imune do parasito e na patogênese de doenças parasitárias. Neste contexto, este trabalho se focaliza no estudo da otubaína de Leishmania chagasi, uma cisteíno protease pertencente às enzimas deubiquitinantes (DUBs). Algumas DUBs são essenciais na imunomodulação e regulação da resposta inflamatória. A otubaína 1 de humanos, por exemplo, possui como substrato a proteína E3 GRAIL associada à anergia dos linfócitos. Este trabalho teve como objetivo a clonagem e expressão da otubaína recombinante de L. chagasi (rOtuLc) bem como sua citolocalização, caracterização de sua atividade e proposição da sua estrutura por modelagem e dinâmica molecular. O gene da OtucLc foi amplificado e seu produto clonado no vetor de expressão, pET-19b, expresso em E. coli BL21 (DE3). A rOtuLc foi induzida com 0,1 mM IPTG, a 16 ºC por 16 h. A proteína recombinante solúvel foi purificada em coluna de agarose-níquel. Anticorpos anti-OtuLc foram produzidos em camundongos e sua especificidade foi confirmada por immunoblot. A imunocitolocalização da OtuLc em promastigotas de L. chagasi revelou sua localização em vesículas e uma marcação pontual de forte intensidade na região anterior, próximo ao cinetoplasto. Testes de atividade da rOtuLc contra os substratos Ub-AMC e Z-LRGG-AMC foram realizados e a rOtuLc mostrou-se inativa. Finalmente, a modelagem molecular por homologia e os ensaios de dinâmica molecular de equilíbrio indicaram que a OtuLc é composta por 10 hélices ? e 1 folha ?, de 4 fitas, e mantém conservado o posicionamento dos resíduos da tríade catalítica, estando o resíduo Cys81 no início de uma hélice ? direita próxima à fita ? onde se encontram os resíduos His261 e Asn263. Estes resultados iniciais poderão servir como ferramentas de grande valia para uma avaliação futura do potencial quimioterápico da OtuLc. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmaniasis are infectious diseases caused by intracellular protozoa of the genus Leishmania which have different clinical manifestations and treatment difficult to administer with serious secondary effects. These diseases still represent a significant public health problem and together with the difficulties encountered in the current treatment reflect the need to advance the search for new drugs. Proteases, enzymes that catalyze the hydrolysis of peptide bonds of proteins and polypeptide chains, play key roles in some protozoan parasites such as life cycle transition, host invasion, parasite immune evasion and parasitic diseases pathogenesis. In this context, this work focuses on studing Leishmania chagasi otubain, a cysteine protease belonging to deubiquitinating enzyme (DUBS). Some DUBs are essential in immunomodulation and regulation of the inflammatory response. The human otubain 1, for example, has the GRAIL E3 protein as substrate, associated with anergy in lymphocytes. The aim of this work was the cloning and expression of recombinant L. chagasi otubain (rOtuLc), the verification of its cytolocalization, the activity characterization and the structure proposition by molecular modeling and dynamics. The OtuLc gene was amplified and the product cloned into the expression vector pET-19b expressed in E. coli BL21 (DE3). Expression of recombinant protein condition was 0,1 mM IPTG, 16 °C for 16 h. The soluble recombinant protein was purified by nickel-agarose column. Anti-OtuLc antibodies were produced in mice and its specificity was confirmed by immunoblot. Cytolocalization of OtuLc in L. chagasi promastigotes revealed vesicular pattern localization and a high-intensity point labeled in the anterior region near the kinetoplast. rOtuLc activity tests against Ub-AMC and Z-LRGG-AMC substracts were performed and the recombinant protein was found to be inactive. Finally, homology molecular modeling and molecular dynamics assay indicated that OtuLc is composed of 10 α helices and 1 β sheet and retains the conserved residues of catalytic triad positioning with Cys81 residue at the beginning of a right handed α helix near to His261 and Asn263 at the β sheet. These initial results may serve as valuable tools for future assessement of the chemotherapeutic potential of OtuLc.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/8604 |
| Date | 03 April 2011 |
| Creators | Guido, Bruna Cândido |
| Contributors | Bastos, Izabela Marques Dourado |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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