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Previous issue date: 2017-08-09 / FACEPE / A leishmaniose é uma infecção causada por diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania. Atualmente não existe vacina disponível para infecções por Leishmania em humanos e os tratamentos convencionais são tóxicos para os pacientes. Por esse motivo, o desenvolvimento de novas drogas leishmanicidas é uma necessidade urgente. No presente trabalho foi avaliada a citotoxicidade, atividade sobre L. amazonensis selvagem in vitro, a produção de óxido nítrico (NO), a secreção das citocinas IL-12, IL-10 e TNF e a indução da morte celular nos parasitas sob a influência de sete novos compostos sintéticos derivados da estrutura das Tiossemicarbazonas (TS01-TS07). Em paralelo, foi realizado o desenvolvimento de linhagens transgênicas de L. amazonensis e L. Infantum expressando constitutivamente a enzima beta-galactosidase para serem utilizadas em testes de atividade leishmanicida. A citotoxicidade das tiossemicarbazonas foi avaliada em macrófagos peritoneais através do método do MTT e o índice de seletividade foi determinado. Foi avaliado o efeito sobre o crescimento e o mecanismo de morte celular induzido pelos compostos sobre formas promastigotas de L. amazonensis, além de sua atividade sobre amastigotas intracelulares. A produção de NO, bem como de citocinas por macrófagos infectados ou não com L. amazonensis tratados ou não com os compostos foi avaliada pelo reagente de Griess e ELISA de captura, respectivamente. Foi realizada a ligação do gene da beta-galactosidase ao vetor para expressão em Leishmania sp. pLEXSY com posterior transfecção e confirmação fenotípica. As leishmanias transgênicas foram submetidas à Anfotericina B para validação de sua utilização em ensaios de atividade leishmanicida. Todos os compostos inibiram o crescimento de formas promastigotas e amastigotas de L. amazonensis selvagem, além de apresentarem baixa citotoxicidade em macrófagos. TS02 na cultura de promastigotas causou morte celular por apoptose e necrose, com efeito similar à Anfotericina B. Os compostos também se mostraram eficazes na modulação de mediadores imunológicos importantes para a doença: NO, TNF, IL-12 e IL-10. Quanto ao desenvolvimento da linhagem transgênica de L. amazonensis e L. infantum, foi confirmada por PCR e ensaio fenotípico a ligação do cassete de expressão contendo o gene da enzima beta-galactosidase ao genoma das leishmanias transfectadas. As linhagens transgênicas mostraram-se prontas para serem utilizadas em ensaios de teste de drogas in vitro, uma vez que promastigotas e amastigotas intracelulares tiveram seu uso validado frente à Anfotericina B. A baixa toxicidade aos macrófagos, a atividade leishmanicida e a presença de citocinas de perfil Th1 apresentadas sugerem a utilização destes compostos, derivados da estrutura da tiossemicarbazona, como agentes promissores para o tratamento da leishmaniose cutânea. Já as linhagens de L. amazonensis e L. infantum expressando a beta-galactosidase estão aptas para serem utilizadas na rotina laboratorial de avaliação de compostos com potencial atividade leishmanicida. / Leishmaniasis is an infection caused by different protozoa belonging to the genus Leishmania. Currently there is no vaccine available for Leishmania infections in humans and conventional treatments are toxic to patients. For this reason, development of new antileishmanial drugs is an urgent need. In present study we evaluated cytotoxicity, in vitro activity on L. amazonensis wild-type, nitric oxide production (NO), IL-12, IL-10 and TNF secretion and cell death induction after incubation with seven new Thiosemicarbazone compounds (TS01- TS07). In parallel, was carried out the development of transgenic lines of L. amazonensis and L. infantum constitutively expressing beta-galactosidase enzyme, for use in leishmanicide activity tests. Cytotoxicity of compounds was evaluated in peritoneal macrophages by MTT method and selectivity index was determined. Effect of compounds on L. amazonensis promastigotes growth was evaluated and cell death mechanism induced determined by flow cytometry, besides its activity against intracellular amastigotes. NO and macrophage cytokine production was evaluated in macrophage infected or not with L. amazonensis, by Griess reagent and ELISA, respectively. The binding of etagalactosidase gene to Leishmania sp. expression vector pLEXSY was done, with subsequent transfection and phenotypic confirmation. Transgenic leishmanias were submitted to Amphotericin B for validation of their use in leishmanicidal activity assays. All compounds inhibited promastigotes and amastigotes growth, besides having low cytotoxicity in macrophages. TS02 in promastigote culture caused cell death by apoptosis and necrosis, with similar results observed with Amphotericin B treatment. Compounds were able to modulate immune mediators relevant to disease as NO, TNF, IL-12 and IL-10. Regarding the development of the transgenic L. amazonensis and L. infantum, the binding of cassette expression containing beta-galactosidase gene to leishmania genome was confirmed by PCR and phenotypic assay. The transgenic leishmanias were ready to be used for in vitro drug test trials, since promastigotes and intracellular amastigotes use were validated against Amphotericin B. The low toxicity to macrophages, leishmanicidal activity and presence of Th1 cytokine profile presented suggest using of thiosemicarbazone derived compounds as promising agents for cutaneous leishmaniasis treatment. On the other hand, L. amazonensis and L. infantum expressing etagalactosidase are apt to be used in the laboratory routine to evaluate compounds with potential leishmanicidal activity.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/26624 |
| Date | 09 August 2017 |
| Creators | SANTOS, Aline Caroline da Silva |
| Contributors | http://lattes.cnpq.br/9260270756078209, HERNANDES, Valéria Pereira, MELO NETO, Osvaldo Pompílio de, MOURA, Danielle Maria do Nascimento |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco, Programa de Pos Graduacao em Inovacao Terapeutica, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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