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Previous issue date: 2008-02-15 / Leptospirosis is a zoonotic disease that occurs all over the world and is caused by
pathogenic bacteria of the genus Leptospira. Clinical manifestations of leptospirosis
are similar to other febrile illnesses and this fact frequently retards beginning of
antibiotic therapy. Thus, early and accurate diagnosis is a prerequisite for proper
treatment of leptospirosis. Pathogenic serovars of Leptospira have a wide antigenic
diversity attributed mainly to the lipopolysacharide present in the outer membrane. In
contrast, antigens conserved among pathogenic serovars are mainly represented by
outer membrane proteins. Surface exposure of a major and highly conserved outer
membrane lipoprotein (LipL32) was recently demonstrated on pathogenic Leptospira.
LipL32 on its recombinant form (rLipL32) was used to immunize BALB/c mice to
develop murine monoclonal antibodies (mAbs). Three mAbs against rLipL32 were
produced, isotyped and evaluated for further use in diagnostic tests of leptospirosis
using different approaches. The mAbs were conjugated to peroxidase and evaluated
in a native protein ELISA with intact and heat-treated leptospiral cells, conjugated to
fluorescein isothiocyanate (FITC) for direct immunofluorescence with intact and
methanol fixed cells and were used for LipL32 immunoprecipitation from leptospiral
cells. rLipL32 mAbs conjugated to peroxidase or used as primary antibody bounded
to intact and heat-treated cells in ELISA, proving that they could be used in enzyme
immunoassays for detection of the native protein. On immunofluorescence assay,
mAbs labeled bacterial cells either intact or methanol fixed. Two mAbs were able to
immunoprecipitate the native protein from live and motile leptospiral cells and,
adsorbed onto magnetic beads, captured intact bacteria from artificially contaminated
human sera for detection by PCR amplification. One mAb was utilized for the
development of an immunoseparation assay coupled to PCR test (IMS/PCR) for
diagnosis of leptospirosis. The antibody adsorved onto magnetic beads captured
leptospires from urine and human sera artificially contaminated for further
amplification of the lipL32 gene by PCR. To ensure PCR accuracy, an internal
amplification control (IAC) was constructed using as amplification targets sequences
of standardized primers specific for pathogenic Leptospira and for a not-related DNA
sequence. The IMS/PCR IAC method developed was able to detect 102 cells per
mL of sera or urine, corresponding to approximately 25 genomic copies per reaction.
These results suggest that the association of LipL32-based immunochemical and
molecular techniques could yield a novel method for the diagnosis of leptospirosis.
Moreover, immunomagnetic separation with mAbs against LipL32 can be used
previous to amplification of other targets in the Leptospira genome by PCR. / A Leptospirose é uma zoonose de ocorrência mundial causada por bactérias do
gênero Leptospira. As manifestações clínicas da leptospirose são similares a outras
doenças febris e este fato frequentemente atrasa o diagnóstico e o início do
tratamento. Portanto, o diagnóstico precoce e acurado da doença é um prerequisito
para o tratamento adequado. Sorovares patogêncios de Leptospira possuem uma
grande variação antigência e esta diversidade é atribuída principalmente ao
lipopolissacarídeo presente na membrana externa. Contrastando com esta
característica, antígenos conservados de sorovares patogênicos são principalmente
representados por proteínas de membrana externa. Recentemente foi comprovada a
exposição da proteína LipL32 na superfície da membrana externa de leptospiras
patogênicas. Neste estudo, LipL32 em sua forma recombinante (rLipL32) foi utilizada
para imunizar camundongos BALB/c e produzir anticorpos monoclonais (mAbs). Três
mAbs contra rLipL32 foram produzidos e caracterizados quanto ao seu potencial
para uso em testes diagnósticos usando diferentes metodologias. Os mAbs foram
conjugados à peroxidase e avaliados quanto a reação com proteina nativa em
células de leptospiras íntegras e rompidas, conjugados com isotiocianato de
fluoresceína (FITC) para uso em imunofluorescência para marcar células de
leptospira intactas e tratadas com metanol, e usados para imunoprecipitar células de
leptospira. Os anticorpos monoclonais anti-LipL32, utilizados em ELISA tanto
conjugados com peroxidase ou como anticorpo primário, ligaram-se às células de
leptospiras intactas ou rompidas pelo calor, provando que podem ser usados em
testes imunoenzimáticos para detecção da proteína nativa. Na imunofluorescência,
os mAbs foram capazes de marcar células da bactéria tanto intactas como fixadas
com metanol. Dois mAbs foram capazes de imunoprecipitar proteina nativa de
leptospiras vivas e móveis, e quando adsorvidos em partículas magnéticas foram
capazes de capturar bactérias para amplificação por PCR. Na seqüência deste
estudo, o mAb 1D9 foi utilizado em estudos de padronização da metodologia de
imunoseparação magnética associada a PCR (IMS/PCR) para diagnóstico de
leptospirose. O anticorpo 1D9 foi adsorvido em partículas magnéticas e utilizado
para capturar leptospiras em soro e urina humanas artificialmente contaminadas
com leptospiras para posterior amplificação. Para assegurar a acurácia da PCR foi
construído um controle interno de amplificação (IAC) específico para a metodologia
desenvolvida utilizando como alvo sequências de primers já padronizados para
exclusiva amplificação de leptospiras patogências e uma sequencia de DNA não
relacionada. A metodologia de IMS/PCR IAC permitiu usar somente um par de
primers na reação de PCR e mostrou ser promissora para diagnóstico de
leptospirose, pois foi capaz de detectar 102 células por mL em amostras de soro e
urina artificialmente contaminadas, correspondendo a amplificação a partir de
aproximadamente 25 cópias do genoma. Os resultados obtidos evidenciam uma
nova perspectiva no diagnóstico da leptospirose através da utilização da proteína
LipL32 em métodos imunoquímicos e moleculares ou pela associação destas
metodologias. A metodologia de imunoseparação com o mAb anti-LipL32 pode ser
utilizada previamente a amplificação de outros alvos do genoma bacteriano por
PCR, já que ela possibilita a separação e concentração exclusiva de Leptospira
patogênica.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpel.edu.br:123456789/1250 |
| Date | 15 February 2008 |
| Creators | Fernandes, Cláudia Pinho Hartleben |
| Contributors | CPF:15711986600, http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783342J3&dataRevisao=null, Dellagostin, Odir Antônio, Aleixo, José Antonio Guimarães |
| Publisher | Universidade Federal de Pelotas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFPel, BR, Biotecnologia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPEL, instname:Universidade Federal de Pelotas, instacron:UFPEL |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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