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Previous issue date: 2015-11-19 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Envenomings resulting from snakebites were classified, in 2009, by the World Health
Organization as a neglected tropical disease. In Brazil, the genus Bothrops sp. is
responsible for most of these accidents and, in the Amazon region, the majority of
snakebite reports is attributed to the species Bothrops atrox. The venom from snakes
of the genus Bothrops sp. is composed by proteins such as phospholipase A2,
metalloproteinases, among others. The hemorrhagic activity is caused by
metalloproteinase which induce vascular damage and ischemic zones which
contribute to the appearance of necrosis in the local tissue. The treatment
recommended by the Ministry of Health of Brazil against snakebites is the antivenom
administration, however, this treatment does not neutralize the local effects
satisfactorily. The coastal communities of Northern Brazil, due to long distances from
health centers, have limited access to serumtherapy treatment and use plants of folk
medicine to block the actions induced by snake venoms. This study investigated the
potential of the aqueous extract of Connarus favosus (AECf) to inhibit hemorrhagic
and phospholipase A2 activities induced by Bothrops atrox venom (BaV) and to
determine the antioxidant and antimicrobial potentials of the extract. AECf was
analyzed phytochemically for secondary metabolites and phenolics (condensed
tannins and hydrolyzable tannins) by colorimetry. Antioxidant activity was evaluated
by quantitative assays using 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and
Fe3+/phenanthroline. Antimicrobial activity was evaluated by the disk diffusion and
minimal inhibitory concentration test, and cytotoxicity was evaluated using human
fibroblast cells (MRC-5). Inhibition of BaV-induced hemorrhagic activity was
assessed after oral administration of the extract using pre-treatment, post-treatment
and combined (BA plus AECf) treatment protocols. Inhibition of indirect hemolysis
caused by phospholipase A2 (PLA2) was investigated in vitro. Interaction between
AECf and BaV was investigated by SDS-PAGE electrophoresis, Western blot (Wb)
and zymography. The phytochemical profile of AECf revealed ten secondary
metabolite classes, and colorimetry showed high total phenolic and total (condensed
and hydrolyzable) tannin content. AECf exhibited high antioxidant and antimicrobial
potentials. The IC50 for the cytotoxic effect was 51.91 (46.86 - 57.50) μg/mL.
Inhibition of BaV-induced hemorrhagic activity was significant in all the protocols, and
inhibition of PLA2 activity was significant with the two highest concentrations. The
BaV/AECf mixture produced the same bands as BaV by itself in SDS-PAGE and Wb
although the bands were much fainter. Zymography confirmed the proteolytic activity
of BaV, but when the venom was pre-incubated with AECf this activity was blocked.
AECf was effective in reducing BaV-induced hemorrhagic activity when administered
by the same route as that used in folk medicine. / Os envenenamentos decorrentes de picadas de serpentes foram classificados, em
2009, pela Organização Mundial da Saúde, como doença tropical negligenciada. No
Brasil, o gênero Bothrops sp. é responsável pela maioria destes acidentes e, na
região Amazônica, grande parte dos relatos de ofidismo é atribuída à espécie
Bothrops atrox. Os venenos das espécies do gênero Bothrops sp. são compostos
predominantemente por proteínas como fosfolipases A2, metaloproteinases,
serinaproteases, entre outros. A atividade hemorrágica é causada pela ação de
metaloproteinases que induzem dano vascular e zonas isquêmicas que contribuem
para o surgimento de necrose do tecido local. O tratamento preconizado pelo
Ministério da Saúde do Brasil para esses acidentes é a administração de antiveneno,
entretanto, este imunobiológico não neutraliza os efeitos locais de forma eficaz. As
comunidades ribeirinhas, da região Norte do Brasil, tem dificuldade de acesso ao
tratamento soroterápico e utilizam plantas da medicina popular para bloquear as
ações induzidas pelos venenos de serpentes. O presente estudo investigou o
potencial do extrato aquoso de Connarus favosus (EACf) em inibir as atividades
hemorrágica e fosfolipásica A2 induzida pela peçonha da serpente Bothrops atrox
(PBa) determinar os potencias antioxidantes e antimicrobianos do extrato. EACf foi
analisado fitoquimicamente para metabólitos secundários e os compostos fenólicos
(taninos condensados e taninos hidrolisáveis) foram determinadas por ensaios
colorimétricos. A ação antioxidante foi avaliada por ensaios quantitativos de 2,2-
difenil-1-picril- hidrazila (DPPH) e Fe3+/Fenantrolina. A ação antimicrobiana foi
avaliada por difusão em disco e concentração mínima inibitória, e a citotoxicidade foi
avaliada utilizando linhagem de fibroblasto humano (MRC-5). A inibição da atividade
hemorrágica induzida pelo PBa foi avaliada por administração via oral do EACf,
seguindo protocolos de pré-tratamento, pós-tratamento e ação coadjuvante (EACf +
soro antibotrópico SAB). A inibição da hemólise indireta causada pela fosfolipase A2
(PLA2) foi testada in vitro. A interação entre EACf e PBa foram avaliadas por
eletroforese SDS-PAGE, Western Blot (Wb) e Zimografia. No perfil fitoquímico foram
identificadas dez classes de metabólitos secundários, e os ensaios colorimétricos
mostraram altas quantidades de fenóis totais e taninos (condensados e
hidrolisáveis). O EACf exibiu alto potencial antioxidante e antimicrobiano. O IC50 do
efeito citotóxico foi 51,91 (46,86 - 57,50) μg/mL. A inibição da atividade hemorrágica
do PBa foi significativa em todos os protocolos testados, e a inibição da PLA2 foi
significativa para as duas concentrações mais altas. A mistura PBa/EACf produziu
as mesmas bandas do veneno isolado no SDS-PAGE e Wb, porém de forma mais
branda. A zimografia confirmou a atividade proteolítica do PBa, mas quando o
veneno foi pré-incubado com o EACf houve bloqueio dessa atividade. O EACf foi
eficaz no bloqueio da atividade hemorrágica da PBa quando administrado nas doses
e via tradicionalmente utilizadas.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:http://localhost:tede/6058 |
| Date | 19 November 2015 |
| Creators | Silva, Thaís Pereira, 41-99133-2676 |
| Contributors | ppgbiotec@ufam.edu.br, Santos, Maria Cristina dos, Mourão, Rosa Helena Veras |
| Publisher | Universidade Federal do Amazonas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFAM, Brasil, Instituto de Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM, instname:Universidade Federal do Amazonas, instacron:UFAM |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 32215883775770440, 600, 500, 1984485651082134923 |
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