O margaridão, nome popular da espécie Tithonia diversifolia (Hemls.) A. Gray (Asteraceae) é uma planta invasiva originária do México e da América Central, encontrada em diferentes ecossistemas tropicais e subtropicais. É utilizada popularmente no tratamento de diferentes problemas de saúde como processos inflamatórios, malária e gastrite. Em detrimento aos vários trabalhos de cunho farmacológico e fitoquímico presentes na literatura sobre esta planta, existem escassos estudos sobre a variação de seus metabólitos, principalmente considerando os efeitos de sazonalidade e influência ambiental, de forma que estudos relacionando essa possível variação com a atividade biológica são ainda mais raros. Neste trabalho investigou-se a influência de diferentes fatores ambientais abióticos (clima e solo) sobre os metabólitos dessa planta pela combinação de técnicas analíticas modernas como UHPLC-DAD-(ESI)-HRMS e RMN (J-resolved), aliadas a métodos estatísticos multivariados, e o efeito da variação do perfil metabólico sobre as atividades antioxidante e fotoprotetora in vitro utilizando-se cultura de células. A análise das amostras de T. diversifolia por UHPLC-DAD-(ESI)-HRMS e por RMN (J-resolved) proporcionou novas informações que permitiram elucidar melhor o padrão de variação sazonal do perfil metabólico para as diferentes partes do vegetal relacionada à influência de fatores do ambiente, utilizando métodos de análise multivariada não supervisionados (HCA e PCA) e supervisionados (OPLS-DA). Foi possível também observar diferenças quanto ao perfil metabólico dos extratos obtidos de espécimes de T. diversifolia coletados em diferentes regiões do Brasil utilizando-se uma abordagem semelhante a utilizada para o estudo de variação sazonal, destacando-se que apesar das diferenças encontradas, foi possível observar a presença de lactonas sesquiterpênicas como compostos majoritários na maioria das amostras analisadas. Os ensaios para atividade antioxidante in vitro, possibilitaram a escolha dos extratos com melhores características para os ensaios de avaliação da eficácia fotoprotetora e fotoquimiopreventiva in vitro. Os resultados dos ensaios para avaliação da atividade antioxidante demonstraram a existência de diferenças para esse tipo de atividade entre as partes da planta, sendo as folhas e raízes mais ativas, principalmente pelo mecanismo de sequestro de radicais livres no meio, de forma que extratos de folhas e raízes foram utilizados para os ensaios em cultura de células. Os dois extratos avaliados apresentaram atividade fotoprotetora para as duas linhagens celulares testadas após exposição à radiação UV-A, reduzindo a formação de EROs intracelular, e pelo aumento da viabilidade celular de queratinócitos HaCaT expostos à radiação UV-B. Os extratos de T. divesifolia não apresentaram fototoxicidade significativa para nenhuma das linhagens celulares testadas após exposição à radiação UV-B. A fotoquimioproteção foi observada para a linhagem HaCaT, na qual o extrato de folhas aumentou a viabilidade celular após a exposição à radiação UV-B nas três maiores concentrações testadas, sendo que na maior concentração (20,0 ?g/mL), não houve diferença estatisticamente significativa em relação ao controle não irradiado. O extrato de folhas também apresentou atividade fotoquimiopreventiva pela inibição da peroxidação lipídica em cultura de queratinócitos HaCaT expostos a radiação UV-B. Considerando-se todos os resultados aqui apresentados, destacamos a relação ambiente-metabolismo em T. diversifolia e o conjunto de técnicas analíticas e estatísticas utilizadas, as quais nos permitiram obter dados confiáveis que contribuem para uma compreensão holística do papel do metabolismo na adaptação da planta ao meio ambiente, e o potencial desta abordagem na busca racional de produtos naturais com atividades biológicas de interesse. / Margaridão, the common name of the species Tithonia diversifolia (Hemls.) A. Gray (Asteraceae), is an invasive plant native from both Mexico and Central America, encountered in different tropical and subtropical ecosystems. It is popularly used for the treatment of various health problems such as inflammation, malaria, and gastritis. Despite the various pharmacologic and phytochemical studies in the literature about this plant, there are few studies on the variation of its metabolites, especially considering the effects of seasonality and environmental influence, so that studies relating this possible variation to biological activity are still rarer. In this work we investigated the influence of different abiotic environmental factors (climate and soil) on the metabolites of this plant by combining modern analytical techniques such as UHPLC-DAD-(ESI)-HRMS and NMR (J-resolved), combined with multivariate statistical methods, and the effect of the variation of the metabolic profile for the antioxidant and photoprotective activities in vitro using cultured cells. The analysis of samples of T. diversifolia by UHPLC-DAD-(ESI)-HRMS and NMR (J-resolved) provided new information which enable to elucidate better the seasonal variation pattern of the metabolic profile for the different parts of the plant related to the influence of the environmental factors, using unsupervised (HCA and PCA) and supervised (OPLS-DA) multivariate analysis methods. It was also possible to observe differences in the metabolic profiles of extracts of T. diversifolia specimens collected in different regions of Brazil using a similar approach to that used for the study of seasonal variation, highlighting that, despite the differences, it was possible observe the presence of sesquiterpene lactones as major compounds in most of the samples analysed. The assays for antioxidant activity in vitro, allowed the choice of extracts with better features for the photoprotective and photochemopreventive in vitro efficacy tests. The results of the assays to evaluate the antioxidant activity demonstrated the existence of differences for this activity between the parts of the plant, being the leaves and roots more actives, mainly by scavenging free radical mechanism, so that leaf and root extracts were used for testing in cell culture. The two extracts showed evaluated photoprotective activity for both cell lines tested after exposure to UV-A radiation, by reducing intracellular ROS formation, and increased cell viability of HaCaT keratinocytes exposed to UV-B radiation. The extracts of T. diversifolia have shown no significantly phototoxicity for any of the tested cell lines after exposure to UV-B radiation. Photochemoprevention was observed for the strain HaCaT in which the leaf extract increased the cell viability after exposure to UV-B radiation at the three highest tested concentrations, while at higher concentration (20.0 mg/mL), there was no difference statistically significant compared to non-irradiated control. The leaf extract also showed photochemopreventive activity by inhibiting lipid peroxidation in cultured HaCaT keratinocytes exposed to UV-B radiation. Considering all results presented herein, we highlight the environment-metabolism relationship for T. diversifolia and the selected set of analytical and statistical techniques allowed us to obtain reliable data that contributed to a holistic understanding of the role of metabolism in the plant\'s adaptation to the environment, and the potential of this approach to the rational search for natural products with biological activity of interest
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-03052017-165352 |
| Date | 25 September 2015 |
| Creators | Sampaio, Bruno Leite |
| Contributors | Costa, Fernando Batista da |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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