O margaridão, nome popular da espécie Tithonia diversifolia (Hemls.) A. Gray (Asteraceae) é uma planta invasiva originária do México e da América Central, encontrada em diferentes ecossistemas tropicais e subtropicais. É utilizada popularmente no tratamento de diferentes problemas de saúde como processos inflamatórios, malária e gastrite. Em detrimento aos vários trabalhos de cunho farmacológico e fitoquímico presentes na literatura sobre esta planta, existem escassos estudos sobre a variação de seus metabólitos, principalmente considerando os efeitos de sazonalidade e influência ambiental, de forma que estudos relacionando essa possível variação com a atividade biológica são ainda mais raros. Neste trabalho investigou-se a influência de diferentes fatores ambientais abióticos (clima e solo) sobre os metabólitos dessa planta pela combinação de técnicas analíticas modernas como UHPLC-DAD-(ESI)-HRMS e RMN (J-resolved), aliadas a métodos estatísticos multivariados, e o efeito da variação do perfil metabólico sobre as atividades antioxidante e fotoprotetora in vitro utilizando-se cultura de células. A análise das amostras de T. diversifolia por UHPLC-DAD-(ESI)-HRMS e por RMN (J-resolved) proporcionou novas informações que permitiram elucidar melhor o padrão de variação sazonal do perfil metabólico para as diferentes partes do vegetal relacionada à influência de fatores do ambiente, utilizando métodos de análise multivariada não supervisionados (HCA e PCA) e supervisionados (OPLS-DA). Foi possível também observar diferenças quanto ao perfil metabólico dos extratos obtidos de espécimes de T. diversifolia coletados em diferentes regiões do Brasil utilizando-se uma abordagem semelhante a utilizada para o estudo de variação sazonal, destacando-se que apesar das diferenças encontradas, foi possível observar a presença de lactonas sesquiterpênicas como compostos majoritários na maioria das amostras analisadas. Os ensaios para atividade antioxidante in vitro, possibilitaram a escolha dos extratos com melhores características para os ensaios de avaliação da eficácia fotoprotetora e fotoquimiopreventiva in vitro. Os resultados dos ensaios para avaliação da atividade antioxidante demonstraram a existência de diferenças para esse tipo de atividade entre as partes da planta, sendo as folhas e raízes mais ativas, principalmente pelo mecanismo de sequestro de radicais livres no meio, de forma que extratos de folhas e raízes foram utilizados para os ensaios em cultura de células. Os dois extratos avaliados apresentaram atividade fotoprotetora para as duas linhagens celulares testadas após exposição à radiação UV-A, reduzindo a formação de EROs intracelular, e pelo aumento da viabilidade celular de queratinócitos HaCaT expostos à radiação UV-B. Os extratos de T. divesifolia não apresentaram fototoxicidade significativa para nenhuma das linhagens celulares testadas após exposição à radiação UV-B. A fotoquimioproteção foi observada para a linhagem HaCaT, na qual o extrato de folhas aumentou a viabilidade celular após a exposição à radiação UV-B nas três maiores concentrações testadas, sendo que na maior concentração (20,0 ?g/mL), não houve diferença estatisticamente significativa em relação ao controle não irradiado. O extrato de folhas também apresentou atividade fotoquimiopreventiva pela inibição da peroxidação lipídica em cultura de queratinócitos HaCaT expostos a radiação UV-B. Considerando-se todos os resultados aqui apresentados, destacamos a relação ambiente-metabolismo em T. diversifolia e o conjunto de técnicas analíticas e estatísticas utilizadas, as quais nos permitiram obter dados confiáveis que contribuem para uma compreensão holística do papel do metabolismo na adaptação da planta ao meio ambiente, e o potencial desta abordagem na busca racional de produtos naturais com atividades biológicas de interesse. / Margaridão, the common name of the species Tithonia diversifolia (Hemls.) A. Gray (Asteraceae), is an invasive plant native from both Mexico and Central America, encountered in different tropical and subtropical ecosystems. It is popularly used for the treatment of various health problems such as inflammation, malaria, and gastritis. Despite the various pharmacologic and phytochemical studies in the literature about this plant, there are few studies on the variation of its metabolites, especially considering the effects of seasonality and environmental influence, so that studies relating this possible variation to biological activity are still rarer. In this work we investigated the influence of different abiotic environmental factors (climate and soil) on the metabolites of this plant by combining modern analytical techniques such as UHPLC-DAD-(ESI)-HRMS and NMR (J-resolved), combined with multivariate statistical methods, and the effect of the variation of the metabolic profile for the antioxidant and photoprotective activities in vitro using cultured cells. The analysis of samples of T. diversifolia by UHPLC-DAD-(ESI)-HRMS and NMR (J-resolved) provided new information which enable to elucidate better the seasonal variation pattern of the metabolic profile for the different parts of the plant related to the influence of the environmental factors, using unsupervised (HCA and PCA) and supervised (OPLS-DA) multivariate analysis methods. It was also possible to observe differences in the metabolic profiles of extracts of T. diversifolia specimens collected in different regions of Brazil using a similar approach to that used for the study of seasonal variation, highlighting that, despite the differences, it was possible observe the presence of sesquiterpene lactones as major compounds in most of the samples analysed. The assays for antioxidant activity in vitro, allowed the choice of extracts with better features for the photoprotective and photochemopreventive in vitro efficacy tests. The results of the assays to evaluate the antioxidant activity demonstrated the existence of differences for this activity between the parts of the plant, being the leaves and roots more actives, mainly by scavenging free radical mechanism, so that leaf and root extracts were used for testing in cell culture. The two extracts showed evaluated photoprotective activity for both cell lines tested after exposure to UV-A radiation, by reducing intracellular ROS formation, and increased cell viability of HaCaT keratinocytes exposed to UV-B radiation. The extracts of T. diversifolia have shown no significantly phototoxicity for any of the tested cell lines after exposure to UV-B radiation. Photochemoprevention was observed for the strain HaCaT in which the leaf extract increased the cell viability after exposure to UV-B radiation at the three highest tested concentrations, while at higher concentration (20.0 mg/mL), there was no difference statistically significant compared to non-irradiated control. The leaf extract also showed photochemopreventive activity by inhibiting lipid peroxidation in cultured HaCaT keratinocytes exposed to UV-B radiation. Considering all results presented herein, we highlight the environment-metabolism relationship for T. diversifolia and the selected set of analytical and statistical techniques allowed us to obtain reliable data that contributed to a holistic understanding of the role of metabolism in the plant\'s adaptation to the environment, and the potential of this approach to the rational search for natural products with biological activity of interest

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:30:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soares_VeronicaCristinaGomes_D.pdf: 49857534 bytes, checksum: b3727eb6c966531052574dc180e90fd1 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Mesmo após décadas do descobrimento dos anti-inflamatórios inibidores de fosfolipase continua a busca por novas moléculas que sejam capazes de apresentar esse efeito terapêutico sem a indução de efeitos colaterais. O objetivo deste estudo foi obter extrato polar de partes aéreas de Tithonia diversifolia, viabilizando um padrão de qualidade para esse extrato a partir da identificação de seus principais constituintes e após essa determinação, avaliar o seu efeito sobre a atividade de frações de fosfolipase A2 básicas secretórias (sPLA2) obtidas de Bothrops jararacussu (Bj) e Crotalus durissus ssp (Cd). Os extratos foram obtidos por infusão e decocção e após a identificação dos constituintes por cromatografia e LC/MS-MS, determinou-se que o extrato de melhor rendimento foi obtido por decocção e que seus principais constituintes são derivados do ácido cinâmico: cafeoil-glicosídico, tagitinina C e ácido quínico. A técnica de molecular imprint (MP) permitiu uma separação dos constituintes sendo uma metodologia prática. O extrato polar apresentou atividade anti-agregante plaquetária na concentração de 0,6 a 20µg/mL, frente ao estímulo de indução por trombina, o que representa que o chá não é tão inerte e que pode promover complicações em indivíduos com distúrbios de coagulação. A purificação de Bj e Cd foi realizada por técnicas cromatográficas, com rendimento de aproximadamente 30% (p<0,05) de sPLA2. Ensaio enzimático in vitro, que utilizou substrato cromogênico sintético de PLA2 o 4-nitro-3-octanoiloxi-benzóico (NOBA) identificou que o extrato polar foi capaz de reduzir em 60% (p<0,05) a atividade enzimática de sPLA2 de Bj, independente do tipo de tratamento aplicado. A redução da atividade de sPLA2 de Cd foi reduzida em 30% (p<0,05) quando a mesma foi incubada por 30 min em presença do extrato. As modificações dos efeitos patológicos causados por sPLA2s foram avaliadas por ensaios in vivo. A ação edematogênica de sPLA2 de Bj foi reduzida em 50% (p<0,05), quando esta estava em presença do extrato, independe de prévia incubação, já a mesma ação para sPLA2 de Cd foi reduzida drasticamente pelo extrato, no entanto, após 60 min da administração do agente indutor de inflamação, a capacidade miotóxica com consequente liberação de creatina-quinase (CK) foi modulada pelo extrato de forma distinta dependendo da fonte de sPLA2. Para sPLA2 de Bj o extrato promoveu uma atividade protetora de liberação de CK, pois reduziu a liberação da enzima quando foi aplicado intraperitoneal 30 min antes do agente agressor, no entanto, a sPLA2 de Cd apresentou capacidade reduzida de liberação de CK quando foi incubada com o extrato por 30min antes da aplicação do mesmo no músculo do cobaio. Diante da ação do extrato sobre a inflamação induzida por sPLA2 buscou-se, através de técnica da reação da polimerase em cadeia em tempo real (PCR em tempo real), determinar a influência do extrato na expressão de genes envolvidos na inflamação. Determinou-se que o gene Nf-Kb, embora responda a presença do extrato, é o que mais tardiamente é ativado (ou expresso), possivelmente por ser nuclear. Através desses ensaios foi possível determinar a ação desses extratos sobre a resposta inflamatória aguda induzida pela ação de sPLA2s de venenos de serpentes / Abstract: Even after decades of the discovery of the anti-inflammatory inhibitors of phospholipase, there is a continuous search for new molecules which are able to provide this therapeutic effect without inducing side effects. The aim of this study was to obtain polar extract of the aerial parts of Tithonia diversifolia, enabling a quality standard for this extract from the identification of its main constituents and after this determination, to evaluate its effect on the activity of fractions A2 phospholipase basic secretory (sPLA2) obtained from Bothrops jararacussu (Bj) and Crotalus durissus ssp (Cd). The extracts were obtained by decoction and infusion and after the identification of the chromatography and LC / MS-MS. It was determined that the best yield of extract was obtained by decoction and its main constituents are cinnamic acid derivatives: caffeoyl - glycosidic, tagitinina C and quinic acid. Molecular imprint technique (MP) enabled separation of the constituents being a practical methodology. The polar extract showed anti-platelet activity at a concentration of 0.6 to 20 ?g/mL, opposite the stimulus induced by thrombin, which indicates that tea is not as inert and may promote complications in patients with coagulation disorders. Purification of Bj and Cd was performed by chromatographic techniques, with a yield of approximately 30% (p<0,05) of sPLA2. In vitro enzyme assay, which used synthetic chromogenic substrate of sPLA2 4-nitro-3-octanoyloxy benzoic acid (NOBA), it was identified that the polar extract was able to reduce by 60% (p<0,05) the enzymatic activity of sPLA2 Bj, regardless of the type of treatment applied, the reduction of the activity of sPLA2 Cd was reduced by 30% (p<0,05) when it was incubated for 30 min in presence of the extract. The modifications of the pathological effects caused by sPLA2s were evaluated by in vivo tests. The edematous action of sPLA2 Bj was reduced by 50% (p<0,05) when it was in presence of the extract, independent of incubation, since the same action for sPLA2 Cd was drastically reduced by the extract, however, after 60 min of administration of the agent inducer of inflammation, the myotoxic capacity with consequent release of creatine - kinase (CK) was modulated by the statement differently depending on the source of sPLA2, sPLA2 Bj to extract promoted a protective activity of CK release, because it reduced the release of enzyme, when applied intraperitoneally, 30 min before the offending agent, however, sPLA2 Cd showed reduced ability to release when CK was incubated with the extract for 30 min before application of the same muscle. Before the action of the extract on the sPLA2 induced inflammation was sought through the technique of polymerase chain reaction in real time (real time PCR), to determine the influence of the extract on the expression of genes involved in inflammation. We determined that Nf - Kb gene was the answer that although the presence of the extract is that the later is activated (or expressed), possibly because it was nuclear. Through these studies it was possible to determine the effect of these extracts on the acute inflammatory response induced by the action of sPLA2s from snake venoms / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Tithonia diversifolia Hemsl. A. Gray (margaridão, Asteraceae) é uma planta medicinal com propriedade anti-inflamatória bastante promissora, embora tenha sido parcialmente investigada do ponto de vista químico e farmacológico. Neste trabalho, a partir de suas folhas foram obtidos um infuso (chá), um extrato de lavagem foliar em acetona rico em lactonas sesquiterpênicas (LSTs), um extrato em metanol-H2O das folhas livres de tricomas (ELT) e o óleo essencial, incluindo das inflorescências. Pela primeira vez os constituintes polares das folhas de T. diversifolia foram identificados e o seu mecanismo de ação anti-inflamatório foi investigado. Através dos perfis químicos dos extratos obtidos por CLAE-UV-DAD e CG-EM, comparação com dados da literatura e de uma biblioteca de padrões, juntamente com a identificação de alguns constituintes isolados, foi possível identificar mais de 20 substâncias desta planta e efetuar a caracterização química de todos seus extratos. O sucesso na obtenção de extratos que refletem diferentes classes de metabólitos secundários de T. diversifolia, avaliados por ensaios anti-inflamatórios in vivo (tópico e oral) e in vitro, permitiu concluir que as LSTs não são as únicas substâncias que contribuem para atividade anti-inflamatória da planta como se acreditava anteriormente. O extrato polar (ELT), rico em ácidos clorogênicos (ACGs) e livre de LSTs, apresentou atividade anti-inflamatória superior à do extrato contendo LSTs, do fármaco de referência (indometacina) e do fitoterápico Acheflan®. Muito similar quimicamente ao ELT, o infuso não apresentou atividade anti-inflamatória interessante, o que nos leva a desestimular seu uso popular. Ainda foi possível demonstrar que a forma de preparar cada extrato causa influência na atividade farmacológica. O estudo do óleo essencial das folhas e inflorescências permitiu observar que seus mono e sesquiterpenos também apresentam atividade anti-inflamatória. Os mecanismos de ação propostos através dos ensaios in vivo e in vitro permitiram definir que as LSTs e/ou flavonas e os ACGs de T. diversifolia são bons anti-inflamatórios, inclusive sem apresentar os efeitos colaterais comuns aos anti-inflamatórios não esteroidais atuais. Além disso, foi possível observar que a toxicidade de todos os extratos testados por via oral foi menor que aquela apresentada pelo fármaco de referência (indometacina) correntemente utilizado na terapêutica. Com base nos resultados obtidos, pode-se afirmar que a T. diversifolia brasileira possui diferentes substâncias com propriedades anti-inflamatórias que agem por diferentes mecanismos de ação. Em pelo menos um destes mecanismos, os extratos demonstraram agir sinergicamente. Embora o emprego de seu infuso não seja recomendado como anti-inflamatório, esta planta é promissora para o desenvolvimento de novos fitofármacos ou como fonte de substâncias anti-inflamatórias. / Tithonia diversifolia Hemsl. A. Gray (Mexican sunflower, Asteraceae) is a very promising anti-inflammatory medicinal plant, although so far it has been partially investigated from the chemical and pharmacological point of view. In this work, an infusion, a sesquiterpene lactone (STL)-rich leaf rinse extract in acetone, a methanol-H2O extract from trichome-free leaves (TFL), and the essential oil were obtained from the leaves of T. diversifolia, including the essential oil from its inflorescences. The main polar constituents were identified in the leaves of T. diversifolia and its anti-inflammatory mechanism of action was determined for the first time. More than 20 compounds from this plant were identified and all extracts were chemically characterized based on chemical profiles obtained from HPLC-UV-DAD and GC-MS analyzes, comparison with literature data,data from our pure compounds library, and on the identification of isolated compounds. The success in obtaining extracts with different classes of secondary metabolites of T. diversifolia allowed, after in vivo (topic and oral) and in vitro anti-inflamatory assays were carried out, to show that the STLs are not the only class of compounds that contribute to the anti-inflammatory activity of this plant as previously believed. The TFL extract, which was proved to be rich in chlorogenic acids and free of LSTs, demonstrated better activity and better mechanism of action than those displayed by the LSTs, the reference drug (indomethacin) and Acheflan® (a phytomedicine). The infusion, which is chemically very similar to the TFL extract, did not show any interesting anti-inflammatory activity, therefore discouraging its popular use. Additionally, it can be stated that the way the extracts are prepared exert influence in their pharmacological activity. The study of the essential oil allowed to observe that its mono e sesquiterpenoids also present anti-inflammatory activity. The mechanisms of action proposed after in vivo and in vitro assays were carried out allowed us to define that the STLs and/or flavones and chlorogenic acids from T. diversifolia are good anti-inflammatory agents; it should also be mentioned that these compounds do not present the side effects which are common to the current non-steroidal anti-inflammatory drugs. Furthermore, it was possible to observe that the toxicity of all extracts tested orally was lower than that presented by the reference drug (indomethacin) commonly used in the treatment of inflammatory diseases. These results altogether allowed us to conclude that the Brazilian T. diversifolia presents different classes of secondary metabolites with anti-inflammatory properties that act through different mechanisms of action. These extracts also displayed a synergistic mechanism. Although the use of the infusion is not recommended as anti-inflammatory remedy, this plant is promising for the development of new phytomedicines or as a source of anti-inflammatory compounds.

Tithonia diversifolia Hemsl. A. Gray (margaridão, Asteraceae) é uma planta medicinal com propriedade anti-inflamatória bastante promissora, embora tenha sido parcialmente investigada do ponto de vista químico e farmacológico. Neste trabalho, a partir de suas folhas foram obtidos um infuso (chá), um extrato de lavagem foliar em acetona rico em lactonas sesquiterpênicas (LSTs), um extrato em metanol-H2O das folhas livres de tricomas (ELT) e o óleo essencial, incluindo das inflorescências. Pela primeira vez os constituintes polares das folhas de T. diversifolia foram identificados e o seu mecanismo de ação anti-inflamatório foi investigado. Através dos perfis químicos dos extratos obtidos por CLAE-UV-DAD e CG-EM, comparação com dados da literatura e de uma biblioteca de padrões, juntamente com a identificação de alguns constituintes isolados, foi possível identificar mais de 20 substâncias desta planta e efetuar a caracterização química de todos seus extratos. O sucesso na obtenção de extratos que refletem diferentes classes de metabólitos secundários de T. diversifolia, avaliados por ensaios anti-inflamatórios in vivo (tópico e oral) e in vitro, permitiu concluir que as LSTs não são as únicas substâncias que contribuem para atividade anti-inflamatória da planta como se acreditava anteriormente. O extrato polar (ELT), rico em ácidos clorogênicos (ACGs) e livre de LSTs, apresentou atividade anti-inflamatória superior à do extrato contendo LSTs, do fármaco de referência (indometacina) e do fitoterápico Acheflan®. Muito similar quimicamente ao ELT, o infuso não apresentou atividade anti-inflamatória interessante, o que nos leva a desestimular seu uso popular. Ainda foi possível demonstrar que a forma de preparar cada extrato causa influência na atividade farmacológica. O estudo do óleo essencial das folhas e inflorescências permitiu observar que seus mono e sesquiterpenos também apresentam atividade anti-inflamatória. Os mecanismos de ação propostos através dos ensaios in vivo e in vitro permitiram definir que as LSTs e/ou flavonas e os ACGs de T. diversifolia são bons anti-inflamatórios, inclusive sem apresentar os efeitos colaterais comuns aos anti-inflamatórios não esteroidais atuais. Além disso, foi possível observar que a toxicidade de todos os extratos testados por via oral foi menor que aquela apresentada pelo fármaco de referência (indometacina) correntemente utilizado na terapêutica. Com base nos resultados obtidos, pode-se afirmar que a T. diversifolia brasileira possui diferentes substâncias com propriedades anti-inflamatórias que agem por diferentes mecanismos de ação. Em pelo menos um destes mecanismos, os extratos demonstraram agir sinergicamente. Embora o emprego de seu infuso não seja recomendado como anti-inflamatório, esta planta é promissora para o desenvolvimento de novos fitofármacos ou como fonte de substâncias anti-inflamatórias. / Tithonia diversifolia Hemsl. A. Gray (Mexican sunflower, Asteraceae) is a very promising anti-inflammatory medicinal plant, although so far it has been partially investigated from the chemical and pharmacological point of view. In this work, an infusion, a sesquiterpene lactone (STL)-rich leaf rinse extract in acetone, a methanol-H2O extract from trichome-free leaves (TFL), and the essential oil were obtained from the leaves of T. diversifolia, including the essential oil from its inflorescences. The main polar constituents were identified in the leaves of T. diversifolia and its anti-inflammatory mechanism of action was determined for the first time. More than 20 compounds from this plant were identified and all extracts were chemically characterized based on chemical profiles obtained from HPLC-UV-DAD and GC-MS analyzes, comparison with literature data,data from our pure compounds library, and on the identification of isolated compounds. The success in obtaining extracts with different classes of secondary metabolites of T. diversifolia allowed, after in vivo (topic and oral) and in vitro anti-inflamatory assays were carried out, to show that the STLs are not the only class of compounds that contribute to the anti-inflammatory activity of this plant as previously believed. The TFL extract, which was proved to be rich in chlorogenic acids and free of LSTs, demonstrated better activity and better mechanism of action than those displayed by the LSTs, the reference drug (indomethacin) and Acheflan® (a phytomedicine). The infusion, which is chemically very similar to the TFL extract, did not show any interesting anti-inflammatory activity, therefore discouraging its popular use. Additionally, it can be stated that the way the extracts are prepared exert influence in their pharmacological activity. The study of the essential oil allowed to observe that its mono e sesquiterpenoids also present anti-inflammatory activity. The mechanisms of action proposed after in vivo and in vitro assays were carried out allowed us to define that the STLs and/or flavones and chlorogenic acids from T. diversifolia are good anti-inflammatory agents; it should also be mentioned that these compounds do not present the side effects which are common to the current non-steroidal anti-inflammatory drugs. Furthermore, it was possible to observe that the toxicity of all extracts tested orally was lower than that presented by the reference drug (indomethacin) commonly used in the treatment of inflammatory diseases. These results altogether allowed us to conclude that the Brazilian T. diversifolia presents different classes of secondary metabolites with anti-inflammatory properties that act through different mechanisms of action. These extracts also displayed a synergistic mechanism. Although the use of the infusion is not recommended as anti-inflammatory remedy, this plant is promising for the development of new phytomedicines or as a source of anti-inflammatory compounds.

Extracts from Tithonia diversifolia (TD) have been widely employed in Central and South America, Asia and Africa to help in the treatment of malaria, a disease to which millions of people are subjected in tropical countries. In spite of this, we were not able to find any scientific report dealing with their effects on the heart muscle functioning or describing their toxic effects. Such gaps are barriers for the TD derivatives to become a phytotherapic agent. Therefore, we have planned this study aiming to clarify the inotropic and toxicological effects of TD derivatives. Their effects on the muscle inotropism were investigated in isolated guinea pig atrium mounted in an organ chamber containing Tyrode solution oxygenated by carbogen mixture (5% CO2, 95% O2). The atria were stretched (1 gf) and stimulated at 2 Hz with suprathreshold electrical pulses. Their contractile forces were captured isommetrically and stored in computer to be analysed off line. The effect of AqF was determined after this fraction be added to the organ bath. The evaluation concerned to its effect on the L-type calcium current (ICa,L) was carried out in ventricular cardiomyocytes isolated according to the steps described by Shioya (2007). The intracellular calcium transients were also studied in these cells previously loaded with FLUO4-AM and monitored by confocal microscopy. The acute (ATx) and subacute (STx) toxicities of the crude extract of TD (CE) were evaluated in rats according to the steps proposed by OECD (2001a,b). Briefly: animals were separated by gender to create one control group and two treated groups. For the ATx study, the animals pertaining to the control group received orally only distilled water, whereas rats pertaining to the treated groups received, respectively, 2.5 g/kg and 5.0 g/kg of CE administered in a unique dose. The animals involved in the study were monitored for abnormal signals during 14 days. In the STx evaluation, the animals of the two treated groups received, respectively, 0.125 g/kg/day CE and 0.250 g/kg/day CE during 30 days. Animals were carefully observed for signals representing physiological and/or behavioral abnormalities. At the end of each toxicological protocol, the animals were anaesthetized for collecting blood and after that they were euthanized for the removal of organs. Our results showed that AqF depresses the atrial contractility in a dose-dependent fashion. However, concentrations greater than 2 g/l cause mechanical alternans , indicating that AqF can disturb the dynamics of the calcium release channels, which are present in the sarcoplasmic reticulum membrane. The effect of AqF on the L-type calcium current (ICa,L) was studied by recording how this fraction changes the inotropic effect produced by increasing concentrations of CaCl2. Our data showed that 2 g/l AqF increased the CaCl2 EC50 from 1.207 ± 0.139 to 2.846 ± 0.035 mM (n = 4, p < 0.05), suggesting that AqF is able to reduce ICa,L. Such conclusion was reinforced by testing the Bowditch phenomenon in atria incubated with 1.3 g/l AqF. In these experiments, AqF completely abolished the force overshoot , which is normally seen in the positive staircase Bowditch phenomenon. The depressant effect of AqF on the ICa,L was also supported by the decrease of intracellular fluorescence related to the subcellular calcium from 6.9 ± 0.4 (n = 53) to 5.3 ± 0.3 u.a. (n = 51; p < 0.05). In fact, direct measurements of ICa,L performed in patch clamped cardiomyocytes, confirmed the depressant effect of AqF on ICa,L. In these experiments, 80 g/ml of AqF reduced the density of ICa,L from 10.00 ± 1.22 to 7.80 ± 1.19 A/F (n = 4, p < 0.05). An expected consequence for the ICa,L reduction is the increase of the time required for the myocardial electrical wave to cross the atrioventricular node. Electrocardiograms from isolated guinea pig hearts confirmed the reduction of ICa,L because in the presence of AqF the heart presented a complete atrioventricular block (AVB). There was no involvement of potassium channels, neither the muscarinic nor the opioids receptors in the AqF myocardial depressant effect. We can conclude that the depressant effects of AqF in the myocardium contractility are due to a reduction of ICa,L. Studies concerned to the ATx and STx showed that the CE does not promote any signal of pain, abnormal behavior or mortality in the rats (DL50>5.0 g/kg). In STx, CE does not change water or food intakes, but in the animals treated with 0.250 g/kg/day a gain of weight occurred, suggesting water retention in the animal s body. Neutropenia, eosinopenia, lymphocytosis, and monocytosis were observed in treated animals during the ATx study. In animals pertaining to the STx study it was seen leucopenia, neutropenia, and monocytopenia. In ATx evaluation, the biochemical profile of the blood showed a reduction in the plasmatic urea but the aspartate and alanine aminotransferases, alkaline phosphatase, total and direct bilirubin, total protein, globulin, sodium, and uric acid increased. Similar results were found in the STx study, except for the urea that remained unchanged and for the glucose, creatinin, albumin, and potassium that presented an increase in their serum levels. These findings advise for precaution when TD derivatives were proposed as a therapeutic agent. We conclude that AqF reduces ICa,L leading to a negative inotropism and an AVB. The CE interferes with the hematopoietic system and promotes injuries for the liver and kidneys leading to a non-inflammatory tissue reaction. / Extratos das folhas da Tithonia diversifolia (TD) têm sido empregados nas Américas do Sul e Central, Ásia e África como agentes antimaláricos entre outros usos. Seus possíveis efeitos sobre o coração e sua toxicidade, contudo, não estão relatados. Estas lacunas comprometem a expectativa de os derivados da planta virem a interessar à indústria de fitoterápicos e por esta razão, o presente trabalho visou complementar tais lacunas, trazendo para o conhecimento as propriedades inotrópicas e toxicológicas de derivados das folhas desta planta. Os estudos inotrópicos foram realizados com a fração aquosa (FAq) e em átrio esquerdo isolado de cobaia montado em cuba para órgão. Os átrios foram estirados a 1 gf e estimulados com pulsos de corrente supralimiares. A força atrial foi captada isometricamente e armazenada em computador. A ação da FAq foi avaliada adicionando-a ao banho. Para estudos com célula isolada, foram obtidos cardiomiócitos pela técnica de dissociação proposta por Shioya (2007). O efeito da FAq sobre a corrente de cálcio tipo L (ICa,L) foi estudado em cardiomiócitos ventriculares de rato e os de camundongo foram usados para estudar os transientes de cálcio subcelular, empregando-se, para isso, a sonda fluorescente Fluo4-AM. Os registros foram feitos com microscopia confocal de varredura a laser. A toxicidade aguda (TxA) e subaguda (TxS) do extrato bruto da TD (EB) foi avaliada em ratos de acordo com as regras da OECD. Resumidamente: os animais foram separados por gênero em grupos controle e tratados. Nos estudos de TxA, os animais do grupo controle receberam água destilada, enquanto que os dos grupos tratados receberam, p.o., 2,5 g/kg e 5,0 g/kg de EB. Os efeitos foram monitorados por 14 dias. Na avaliação referente à TxS, os grupos tratados receberam, p.o., durante 30 dias, 0,125 g/kg/dia ou 0,250 g/kg/dia de EB. Os animais foram observados para sinais de alterações fisiológicas e/ou comportamentais. Em seguida, foram anestesiados, o sangue coletado e depois eutanasiados para a histopatologia dos órgãos. Os resultados mostraram que a FAq deprime a contratilidade atrial e que concentrações acima de 2 g/l induzem o alternância mecânica, sugerindo que ela leva à disfunção dos canais liberadores de cálcio existentes no retículo sarcoplasmático. Para avaliar a ação da FAq sobre a ICa,L, foi estudada a sua ação sobre a curva concentração-efeito para o CaCl2. Neste estudo, a FAq produziu aumento da CE50 de 1,207 ± 0,139 mM para 2,846 ± 0,035 mM (n = 4, p < 0,05). A incubação do átrio com 1,3 g/l de FAq aboliu completamente o overshoot de força do fenômeno de Bowditch (n = 4, p < 0,05), indicando que ela reduz ICa,L. Esta hipótese foi igualmente suportada no fato de que a fração diminuiu a fluorescência para o cálcio subcelular de 6,9 ± 0,4 u.a. (n = 53) para 5,3 ± 0,3 u.a. (n = 51; p < 0,01) e também porque, quando empregada a 80 g/ml, ela reduziu a densidade da ICa,L de 10,00 ± 1,22 A/F para 7,80 ± 1,19 A/F (n = 4, p < 0,05). A FAq produziu bloqueio de condução no nódulo atrioventricular. O mecanismo de ação da FAq não envolveu receptores muscarínicos, opióides, nem canais para potássio, mas está baseado na diminuição da ICa,L. A avaliação da TxA e TxS mostrou que o EB é de baixa toxicidade pois sua DL50 foi maior do que 5,0 g/kg. O EB não alterou o consumo de água ou de comida, mas nos animais tratados com 0,250 g/kg/dia houve ganho de peso, sugerindo retenção hídrica, pois o peso dos órgãos não se modificou. Neutropenia, eosinofilopenia, linfocitose e monocitose foram observadas na TxA, mas na TxS ocorreu leucopenia, neutropenia e monocitopenia. A análise bioquímica na TxA mostrou redução da ureia plasmática, porém aumento da aspartato e da alanina aminotransferases, fosfatase alcalina, bilirrubinas total e direta, proteína total, globulina, sódio e ácido úrico. Resultados semelhantes foram encontrados nos estudos sobre a TxS, exceto para ureia, que se manteve constante e para glicose, creatinina, albumina e potássio, cujos níveis sanguíneos aumentaram. A histopatologia mostrou sinais de injúria hepática e renal. Concluimos que a FAq reduz a ICa,L como consequência ela é inotrópica negativa e induz BAV. Ela interfere com o sistema hematopoiético e promove lesão hepática e renal sem causar mortalidade e induz reação inflamatória tissular.

Résumé La plupart des régions équatoriales humides, dont fait partie le Rwanda, sont caractérisées par une altération avancée des roches, des températures relativement élevées, de fortes intensités des pluies qui se traduisent par des phénomènes de ruissellement et dérosion accompagnées par la lixiviation déléments nutritifs avec pour corollaires lacidification et la réduction de la fertilité des sols. Lun des moyens daméliorer la fertilité passe par la mise en uvre de techniques destinées à modifier les caractéristiques défavorables du sol. Ce travail a pour objectif dévaluer les effets de lapport dans le sol de biomasses végétales fraîches collectées dans le milieu naturel, combinées avec du travertin, sur lamélioration de la fertilité et de la productivité des sols acides du Rwanda. Afin datteindre ce but, deux types dessais ont été mis en place sur le terrain au niveau du site de Rubona en moyenne altitude et de Gakuta en haute altitude. Il sagit tout dabord dun essai portant sur la mise en culture en milieu naturel de deux espèces végétales Tithonia diversifolia (Hemsley) A Gray et Tephrosia vogelii (Hook F) et lévaluation de leur production en biomasse et en quantités déléments. Lautre essai, consiste en lévaluation des caractéristiques des sols et des rendements de la culture du maïs des parcelles fertilisées avec les biomasses de ces espèces et/ou de NPK chacun combiné ou non avec du travertin. Le choix de Tithonia diversifolia a été basé sur son potentiel fertilisant et de production en biomasse tandis que celui de Tephrosia vogelii sur son utilisation dans les exploitations agricoles sous forme de haie anti-érosive. Les résultats obtenus indiquent que ces espèces ont un potentiel élevé de production en biomasse et en accumulation déléments dans leurs milieux écologiques favorables. Elles donnent des rendements de 18,7 t.ha-1.an-1 pour Tithonia diversifolia à Rubona et 11,4 t.ha-1.an-1 pour Tephrosia vogelii à Gakuta. Au terme de quatre saisons culturales dexpérimentation, les traitements avec la biomasse de Tithonia diversifolia combinée au travertin ont significativement augmenté le pH, la CECE, le Veff et réduit le taux de saturation en aluminium échangeable dans les deux sites. A Rubona, laugmentation de 0,8 unité de pH a induit un écart positif de 43,9 % et 2,9 cmolc.kg-1 de sol respectivement pour Veff et de CECE et une réduction de 60 à 11 % pour mAl. A Gakuta, ces écarts sont respectivement de 20,5 % et 4,1 cmolc.kg-1 de sol et de 20 à 0,4 % pour une amélioration de 0,7 unité de pH. Ce même traitement et celui relatif à la biomasse de Tithonia diversifolia seule ont amélioré les teneurs en Cot des sols de 0,1 à 0,5 %. Les effets des traitements sur la disponibilité du phosphore sont les plus marqués avec lengrais minéral NPK utilisé seul ou en combinaison avec le travertin. Les teneurs correspondantes ont été multipliées par 2,8 et 2,7 à Rubona et 1,3 à Gakuta à la quatrième saison. Sagissant des paramètres microbiologiques du sol (azote microbien, carbone microbien, respiration basale et respiration induite par le substrat), une amélioration sensible a été observée dans les traitements avec la biomasse de Tithonia diversifolia ou de Tephrosia vogelii en combinaison avec le travertin ou de la biomasse de Tithonia diversifolia appliquée seule. Lanalyse des échantillons de terres par la méthode de spectroscopie proche infrarouge a permis de prédire avec la meilleure précision (0,8<r2<1,0 et 2,3<RPD<5,4) la plupart des paramètres chimiques et microbiologiques pris en compte dans cette étude (pH, Cot, Nt, CEC, CECE, Nmic, Cmic, RBAS, RIS). Pour le maïs, les rendements en biomasse et en grains sont positivement influencés par le traitement avec la biomasse de Tithonia diversifolia combinée avec du travertin. Ce traitement présente une meilleure efficience agronomique. A la quatrième saison, le rendement en grain pour ce traitement a été multiplié par 4,7 et 2,8 par rapport au témoin respectivement à Rubona et à Gakuta.