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Previous issue date: 2017-08-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Listeria monocytogenes é uma bactéria Gram-positiva comumente encontrada no ambiente de processamento de alimentos, produtos in natura e processados. Esse patógeno é reconhecido como o agente causador da listeriose, uma doença grave que afeta principalmente indivíduos de grupos de risco. O presente estudo teve como objetivo caracterizar isolados de L. monocytogenes recuperados no Brasil a partir de fontes clínicas, ambiente de processamento de produtos cárneos, e de carne bovina. Os perfis de susceptibilidade aos antibióticos, genes de virulência, diversidade de sorotipos, capacidade de invadir, replicar e se disseminar em células hospedeiras, bem como a morte celular e a produção de IFN induzidas por isolados de L. monocytogenes foram caracterizados. Todos os isolados apresentaram sensibilidade aos antimicrobianos utilizados para o tratamento da listeriose, no entanto a maioria apresentou resistência ou resistência intermediária à clindamicina e à oxacilina. A sorotipagem molecular produziu resultados contraditórios para sete isolados do sorotipo 1/2a, que foram positivos para o gene lmo1118 e exibiram o perfil IIc (sorotipos 1/2c ou 3c). Além disso, quinze isolados do sorotipo 4b amplificaram o gene lmo0737, e foram classificados como atipico IVb-v1. O potencial de invadir células Caco-2 foi significativamente afetado pela presença de codons de parada prematuros (PMSCs) no gene inlA do sorotipo 1/2c (p < 0,005). As cepas variaram amplamente em seus tempos de duplicação intracelular em celulas Caco- 2, e não houve relação clara entre sorotipo ou fonte. Foram observadas diferenças significativas entre os sorotipos com relação a disseminação em células Caco-2; isolados do sorotipo 1/2a apresentaram defeito na disseminação celular, enquanto isolados do sorotipo 1/2b apresentaram maior habilidade de disseminação celular (p <0,0001). Além disso, identificamos três isolados de sorotipo 4b que se disseminaram em uma área aproximadamente duas vezes maior que a cepa de referência 10403S. Não foram observadas tendências quanto aos tempos duplicação intracelular em iBMDM, comparando fontes de isolamento e sorotipos. Os resultados indicam que a replicação intracelular é determinada pelas características genotípicas de cada isolado. A morte celular induzida por alguns isolados após a infecção de iBMDM foi dependente da enzima Caspase 1, indicando que eles induzem morte celular por piroptose. Alguns isolados também induziram alta produção de INF pela linhagem celular iBMDM. Usando macrófagos primários, foi revelado que a produção de INF foi sempre STING dependente, em alguns casos totalmente cGAS independente, parcialmente cGAS dependente, ou mesmo cGAS dependente. Este trabalho caracterizou o perfil patogênico de isolados de L. monocytogenes, permitindo uma melhor compreensão dos mecanismos de infectividade desse patógeno, e levando a uma análise mais profunda dos genomas e outras abordagens experimentais para revelar os mecanismos associados aos fenótipos de virulência mais extremos. / Listeria monocytogenes is a Gram-positive bacterium commonly isolated from food processing environment, raw and processed foods. It is recognized as the causative agent of listeriosis, a serious disease that affects mainly individuals from risk groups. The present study aimed to characterize L. monocytogenes isolates recovered in Brazil from clinical sources, meat processing environmental and beef. Antibiotic resistance profiles, virulence genes, serotype diversity, ability to invade, replicate and spread in host cells, as well as cell death and IFN production induced by L. monocytogenes isolates were characterized. All isolates presented sensitivity to antimicrobials used for listeriosis treatment while most of them presented resistance or intermediate resistance to clindamycin and oxacillin. Molecular serogrouping produced contradictory results for seven isolated from serotype 1/2a, which were positive for the gene lmo1118 and exhibited the profile IIc (serotypes 1/2c or 3c). In addition, fifteen isolates from serotype 4b amplified the gene lmo0737, being classified as atypical IVb-v1. The potential to invade Caco-2 cells was significantly affected by the presence of premature stop codons (PMSCs) in inlA gene of isolates from serotype 1/2c (p < 0.005). The isolates varied widely in their intracellular doubling times, and there was no clear relationship between serotype or source. There were significant differences between serotypes for cell-to-cell spread in Caco-2 cells, isolates from serotype 1/2a were generally impaired in their spreading ability while most os isolates from serotype 1/2b exhibited increased spreading ability (p < 0.0001). In addition, we identified three isolates from serotype 4b that spread nearly twice as much as the reference strain 10403S. No trends were observed regarding intracellular doubling times in iBMDM by comparing sources and serotypes; based on these results, intracellular growth seems to be determined by genetic characteristics of each strain. The cell death induced by some isolates after infection of iBMDM was Caspase 1 dependent, indicating that they induce pyroptosis. Some of these isolates also induced high INF production by iBMDM. Using primary macrophages, it was revealed that INF production was always STING dependent, and in some cases it is fully cGAS independent, partially cGAS dependent, or even mostly cGAS dependent. We have characterized L. monocytogenes isolates that could provide novel insight into infectivity of this pathogen that may not be revealed by studying common laboratory strains, demanding further analysis of their genomes and other experimental approaches to reveal the mechanisms associated with the most extreme phenotypes exhibited.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:123456789/17751 |
| Date | 25 August 2017 |
| Creators | Camargo, Anderson Carlos |
| Contributors | Nero, Luís Augusto |
| Publisher | Universidade Federal de Viçosa |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | English |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFV, instname:Universidade Federal de Viçosa, instacron:UFV |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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