Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-08-24T13:21:13Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1177730 bytes, checksum: ae33210f9ef99d122bd42327540bae5c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-24T13:21:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1177730 bytes, checksum: ae33210f9ef99d122bd42327540bae5c (MD5) Previous issue date: 2017-06-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Bactérias ácido lácticas (BAL) foram isoladas do ambiente de produção de leite e avaliadas quanto ao potencial benéfico. Testes preliminares e análise por PCR foram aplicados para selecionar e identificar através de sequenciamento de rRNA 16S 15 cepas de BAL: Lactobacillus (n = 11; Lb. casei MSI1, Lb. casei MSI5, Lb. casei MRUV1, Lb. casei MRUV6, Lb. acidophilus MVA3, Lb. nagelli MSIV4, Lb. harbinensis MSI3, Lb. harbinensis MSIV2, Lb. fermentum SIVGL1, Lb. plantarum MLE5 e Lb. plantarum MSI2), Pediococcus (n = 2; P. pentosaceus MLEV8 e P. acidilactici MSI7) e Weissella (n = 2; W. paramesenteroides MRUV3 e W. paramesenteroides MSAV5). Todas as linhagens selecionadas apresentaram resistência ao baixo pH e à presença de sais biliares. O teste API ZYM foi realizado para caracterizar a atividade enzimática entre as cepas e foi observada elevada atividade β-galactosidase em 13 delas. Todas as cepas apresentaram alta taxa de sobrevivência ao suco gástrico e as condições intestinais simulados, capacidade de auto-agregação e co- agregação com micro-organismos indicadores e alta hidrofobicidade da superfície celular. A maioria das cepas foi positiva para os genes de adesão map e EFTu. Os resultados de deconjugação de sais biliares mostraram forte desconjugação para todas as cepas. Todas as cepas mostraram bons resultados para assimilar lactose. Após esta etapa de caracterização do potencial benéfico, as 15 BAL foram avaliadas quanto ao potencial de virulência e de resistência antimicrobiana. A produção de fatores de virulência (hemólise, gelatinase, lipase, desoxirribonuclease e aminas biogênicas: lisina, tirosina, histidina e a ornitina) foi avaliada por métodos fenotípicos, a 25 °C e 37 °C, bem como a resistência a 17 antibióticos. Os isolados foram também submetidos à análise de PCR para identificar a presença de 49 genes associados a fatores de virulência. Nenhuma das cepas apresentou atividade hemolítica, produção de gelatinase, lipase, desoxirribonuclease e aminas biogênicas. Das 15 cepas selecionadas, para 12 tipos de antibióticos no método de difusão em disco, todas as amostras foram resistentes à oxacilina e sulfa/trimetoprim, 14 foram resistentes a gentamicina, 11 foram resistentes a clindamicina, nove cepas foram resistentes à vancomicina, oito cepas para rifampicina, cinco foram resistentes a eritromicina, quatro foram resistentes à tetraciclina, duas cepas foram resistentes à ampicilina, uma cepa foi resistente ao cloranfenicol e nenhuma apresentou resistência ao imipenem. Para um teste quantitativo do antibiograma, 5 antibióticos em fitas Etest® (bioMérieux) foram selecionados. Todas as 15 cepas foram resistentes à vancomicina, duas para rifampicina, uma para gentamicina e uma para o cloranfenicol. Em relação aos genes relacionados com virulência, 19 dos 49 genes testados estavam presentes em algumas cepas. Após a caracterização do potencial virulento das 15 BAL, estas foram avaliadas quanto ao potencial tecnológico para aplicação na indústria de laticínios. Todas as cepas apresentaram capacidade de acidificação, atingindo valores de pH entre 0.73 e 2.11 em 24 horas: Lb. casei MRUV6 apresentou maior capacidade de acidificação (pH 2.11 após 24 h). Dez cepas foram capazes de produzir diacetil a 37 °C, com exceção de Lb. casei MSI1, Lb. harbinensis MSI3, Lb. fermentum SIVGL1, Lb. plantarum MLE5 e W. paramesenteroides MRUV3. Todas as cepas foram capazes de produzir exopolissacarídeos, e apenas duas cepas apresentaram atividade proteolítica (Lb. casei MSI5 e W. paramesenteroides MSAV5). Com base nessa caracterização, Lb. casei MRUV6 foi selecionado para produzir o leite fermentado, armazenado a 4 °C e 10 °C e monitorado até 35 dias de vida útil. As amostras foram submetidas a métodos fenotípicos e moleculares para avaliar a presença de Lb. casei MRUV6 (plaqueamento convencional e RT-PCR, verificando a expressão de gapdh, um gene housekeeping) e verificar a expressão do gene bsh, relacionado à resistência à sais biliares (RT-PCR). A população de Lb. casei MRUV6 se apresentou estável durante todo o período de armazenamento a 4 °C e 10 °C a níveis em torno de 9.9 log UFC/g e também pelo monitoramento da expressão do controle endógeno GAPDH. No entanto, o gene bsh não foi expresso durante o período de armazenamento. O estudo demonstrou o potencial uso da cepa de Lb. casei MRUV6 isolada de um ambiente lácteo para a produção de um produto lácteo fermentado e sua estabilidade durante o armazenamento a 4 °C e 10 °C. Todos os isolados do estudo apresentaram características benéficas, segurança para utilização em alimentos e potencial tecnológico para utilização na indústria de laticínios. Além disso, os mesmos podem ainda ser submetidos a estudos adicionais para avaliações in vivo e realizar a caracterização como probióticos. / Lactic acid bacteria isolated from dairy environment were evaluated for beneficial potential. Preliminary screening and PCR analysis were applied to select and identified through 16s rRNA sequencing 15 LAB strains: Lactobacillus (n = 11; Lb. casei MSI1, Lb. casei MSI5, Lb. casei MRUV1, Lb. casei MRUV6, Lb. acidophilus MVA3, Lb. nagelli MSIV4, Lb. harbinensis MSI3, Lb. harbinensis MSIV2, Lb. fermentum SIVGL1, Lb. plantarum MLE5 and Lb. plantarum MSI2), Pediococcus (n = 2; P. pentosaceus MLEV8 and P. acidilactici MSI7) and Weissella (n = 2; W. paramesenteroides MRUV3 and W. paramesenteroides MSAV5). All selected strains showed resistance to acidic pH and to presence of bile salt. API ZYM test characterized enzymatic activity of the strains and high β-galactosidase activity was observed in 13 strains. All strains presented high values for survival rate to simulated gastric and intestinal conditions, ability to auto and co-aggregate with indicators microorganisms and high cell surface hydrophobicity. Most of the strains were positive for map and EFTu beneficial genes. Strong bile salts deconjugation was applied for all strains and all strains showed good results for assimilating lactose. After this first part of the study, the 15 BAL were evaluated for potential virulence and antimicrobial resistance. The production of virulence factors (hemolysis, gelatinase, lipase, deoxyribonuclease and biogenic amines: lysine, tyrosine, histidine and ornithine) was assessed by phenotypic methods at 25 °C and 37 °C, as well as the resistance to 17 antimicrobials. The isolates were also subjected to PCR to identify the presence of 49 genes associated with virulence factors. None of the strains presented hemolytic activity or the production of gelatinase, lipase, deoxyribonuclease and tested biogenic amines. Of the 15 selected cultures, for 12 types of antibiotics in the disc diffusion method, all strains were resistant for oxacillin and sulfa/trimethoprim, 14 were resistant to gentamicin, 11 were resistant to clindamycin, nine strains were resistant to vancomycin, eight strains to rifampicin, five were resistant to erythromycin, four were resistant to tetracycline, two strains were resistant to ampicillin, one strain was resistant to chloramphenicol and none was resistant for imipenem. For a quantitative test of the antibiogram, five antibiotics were selected in Etest ® strips (bioMérieux). All 15 strains were resistant to vancomycin, two for rifampicin, one for gentamicin and one for chloramphenicol. Regarding the virulence related genes, 19 genes from 49 tested were present in some strains. Results showed that five cultures showed the presence of the int gene, four cultures showed the presence of the ant(4')-Ia gene, three cultures were positive for vanC2, cpd and tdc, two cultures for vanA, tet(K), tet(S), ermA, bcrR, mur-2ed, asa1 and ccf, and one culture was positive for vanC1, ermB, aph(3')-IIIa, aac(6’)-le-aph(2”)-Ia, bcrB and hyl. After characterizing the virulent potential of the 15 BAL, these strains were evaluated for the technological potential for application in the dairy industry. All strains presented acidification capacity, reaching pH values between 0.73 and 2.11 in 24 hours: Lb. casei MRUV6 presented the highest acidification ability (pH 2.11 after 24 h). Ten strains were able to produce diacetyl at 37 °C, except by Lb. casei MSI1, Lb. harbinensis MSI3, Lb. fermentum SIVGL1, Lb. plantarum MLE5 and W. paramesenteroides MRUV3. All strains were able to produce exopolysaccharides, and only two strains presented proteolytic activity (Lb. casei MSI5 and W. paramesenteroides MSAV5). Based on this characterization, Lb. casei MRUV6 was selected for producing fermented milk, stored at 4 °C and 10 °C and monitored until 35 days of shelf life. Samples were subjected to phenotypical and molecular methods to quantify the presence of Lb. casei MRUV6 (conventional plating and RT-PCR, by checking the expression of gapdh, a housekeeping gene) and to verify the expression of bsh gene, related to resistance to bile salts (RT-PCR). Lb. casei MRUV6 population was stable during storage period at 4 and 10 °C at levels around 9.9 log CFU/g, and by monitoring the expression of gapdh gene. However, bsh gene was not expressed during storage period. The study demonstrated the potential use of the beneficial strain Lb. casei MRUV6 isolated from a dairy environment for the production of a fermented milk product, and its stability during storage at 4 and 10 °C. All isolates from the study presented beneficial characteristics, safety for use in food and technological potential for use in the dairy industry. In addition, they may further be subjected to further studies for in vivo evaluations and characterization as probiotics.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-02-21T13:02:13Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2137513 bytes, checksum: 7725910b3e0d21458b72ca20693db1f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-21T13:02:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2137513 bytes, checksum: 7725910b3e0d21458b72ca20693db1f2 (MD5) Previous issue date: 2017-08-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Listeria monocytogenes é uma bactéria Gram-positiva comumente encontrada no ambiente de processamento de alimentos, produtos in natura e processados. Esse patógeno é reconhecido como o agente causador da listeriose, uma doença grave que afeta principalmente indivíduos de grupos de risco. O presente estudo teve como objetivo caracterizar isolados de L. monocytogenes recuperados no Brasil a partir de fontes clínicas, ambiente de processamento de produtos cárneos, e de carne bovina. Os perfis de susceptibilidade aos antibióticos, genes de virulência, diversidade de sorotipos, capacidade de invadir, replicar e se disseminar em células hospedeiras, bem como a morte celular e a produção de IFN induzidas por isolados de L. monocytogenes foram caracterizados. Todos os isolados apresentaram sensibilidade aos antimicrobianos utilizados para o tratamento da listeriose, no entanto a maioria apresentou resistência ou resistência intermediária à clindamicina e à oxacilina. A sorotipagem molecular produziu resultados contraditórios para sete isolados do sorotipo 1/2a, que foram positivos para o gene lmo1118 e exibiram o perfil IIc (sorotipos 1/2c ou 3c). Além disso, quinze isolados do sorotipo 4b amplificaram o gene lmo0737, e foram classificados como atipico IVb-v1. O potencial de invadir células Caco-2 foi significativamente afetado pela presença de codons de parada prematuros (PMSCs) no gene inlA do sorotipo 1/2c (p < 0,005). As cepas variaram amplamente em seus tempos de duplicação intracelular em celulas Caco- 2, e não houve relação clara entre sorotipo ou fonte. Foram observadas diferenças significativas entre os sorotipos com relação a disseminação em células Caco-2; isolados do sorotipo 1/2a apresentaram defeito na disseminação celular, enquanto isolados do sorotipo 1/2b apresentaram maior habilidade de disseminação celular (p <0,0001). Além disso, identificamos três isolados de sorotipo 4b que se disseminaram em uma área aproximadamente duas vezes maior que a cepa de referência 10403S. Não foram observadas tendências quanto aos tempos duplicação intracelular em iBMDM, comparando fontes de isolamento e sorotipos. Os resultados indicam que a replicação intracelular é determinada pelas características genotípicas de cada isolado. A morte celular induzida por alguns isolados após a infecção de iBMDM foi dependente da enzima Caspase 1, indicando que eles induzem morte celular por piroptose. Alguns isolados também induziram alta produção de INF pela linhagem celular iBMDM. Usando macrófagos primários, foi revelado que a produção de INF foi sempre STING dependente, em alguns casos totalmente cGAS independente, parcialmente cGAS dependente, ou mesmo cGAS dependente. Este trabalho caracterizou o perfil patogênico de isolados de L. monocytogenes, permitindo uma melhor compreensão dos mecanismos de infectividade desse patógeno, e levando a uma análise mais profunda dos genomas e outras abordagens experimentais para revelar os mecanismos associados aos fenótipos de virulência mais extremos. / Listeria monocytogenes is a Gram-positive bacterium commonly isolated from food processing environment, raw and processed foods. It is recognized as the causative agent of listeriosis, a serious disease that affects mainly individuals from risk groups. The present study aimed to characterize L. monocytogenes isolates recovered in Brazil from clinical sources, meat processing environmental and beef. Antibiotic resistance profiles, virulence genes, serotype diversity, ability to invade, replicate and spread in host cells, as well as cell death and IFN production induced by L. monocytogenes isolates were characterized. All isolates presented sensitivity to antimicrobials used for listeriosis treatment while most of them presented resistance or intermediate resistance to clindamycin and oxacillin. Molecular serogrouping produced contradictory results for seven isolated from serotype 1/2a, which were positive for the gene lmo1118 and exhibited the profile IIc (serotypes 1/2c or 3c). In addition, fifteen isolates from serotype 4b amplified the gene lmo0737, being classified as atypical IVb-v1. The potential to invade Caco-2 cells was significantly affected by the presence of premature stop codons (PMSCs) in inlA gene of isolates from serotype 1/2c (p < 0.005). The isolates varied widely in their intracellular doubling times, and there was no clear relationship between serotype or source. There were significant differences between serotypes for cell-to-cell spread in Caco-2 cells, isolates from serotype 1/2a were generally impaired in their spreading ability while most os isolates from serotype 1/2b exhibited increased spreading ability (p < 0.0001). In addition, we identified three isolates from serotype 4b that spread nearly twice as much as the reference strain 10403S. No trends were observed regarding intracellular doubling times in iBMDM by comparing sources and serotypes; based on these results, intracellular growth seems to be determined by genetic characteristics of each strain. The cell death induced by some isolates after infection of iBMDM was Caspase 1 dependent, indicating that they induce pyroptosis. Some of these isolates also induced high INF production by iBMDM. Using primary macrophages, it was revealed that INF production was always STING dependent, and in some cases it is fully cGAS independent, partially cGAS dependent, or even mostly cGAS dependent. We have characterized L. monocytogenes isolates that could provide novel insight into infectivity of this pathogen that may not be revealed by studying common laboratory strains, demanding further analysis of their genomes and other experimental approaches to reveal the mechanisms associated with the most extreme phenotypes exhibited.

Made available in DSpace on 2016-11-30T14:53:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 109298_Tairone.pdf: 462217 bytes, checksum: 018f10edf4e61c6113e1b96c10be31af (MD5) license.txt: 214 bytes, checksum: a5b8d016460874115603ed481bad9c47 (MD5) Previous issue date: 2012 / A tuberculose bovina é uma doença de caráter granulomatoso e crônica, sendo que no Brasil apresenta alto índice de morbidade nos rebanhos. O objetivo deste estudo foi avaliar o rendimento da reação em cadeia da polimerase (PCR) no isolamento de micobactérias em amostras teciduais congeladas de bovinos. As amostras teciduais foram descongeladas e semeadas em meios de cultura Ogawa-Kudoh contendo piruvato de sódio, e outro contendo glicerol por 42 dias a 37ºC. Foram submetidas à PCR as amostras de tecido e os isolados das culturas, com primers específicos para M. tuberculosis e M. bovis. Foram analisadas 69 amostras teciduais de bovinos, das quais 81,2% constituíram-se de linfonodos. Tomando-se o resultado combinado das culturas como padrão áureo, identificou-se a presença de micobactérias em 17 amostras teciduais (24,6%), 12 delas (70,6%) pertencentes ao Complexo Mycobacterium tuberculosis (Complexo MTB), e 5 (29,4%) identificadas como Micobactérias Não Tuberculosas (MNT). O melhor rendimento diagnóstico foi alcançado pela cultura específica Ogawa-Kudoh com Piruvato e com descontaminação. O rendimento da PCR realizada nas amostras teciduais com o gene alvo hsp65 em comparação com o padrão áureo, foi de 17,6% de sensibilidade (IC95%:-0,005-0,36), especificidade de 98,1% (IC95%:0,94-1,02), valor preditivo positivo de 75% (IC95%:0,33-1,17), valor preditivo negativo de 78,5% (IC95%:0,68-1,19), e acurácia de 78,3%. A razão de verossimilhança positiva foi de 9,18 e a negativa foi de 0,8. A PCR hsp65 realizada diretamente do tecido acometido apresentou alta especificidade e valor preditivo positivo, porém baixa sensibilidade, sendo desejável a otimização desta técnica para que possa ser utilizada na rotina laboratorial. / Brazilian cattle herds have high morbidity rates due to bovine tuberculosis, which is a chronic granulomatous disease. The aim of this study was to evaluate the performance of the polymerase chain reaction (PCR) in the recovery of mycobacteria from frozen tissue samples of cattle. The tissue samples were frozen-thawed and seeded into Ogawa-Kudoh culture media, one containing sodium pyruvate and another containing glycerol for 42 days at 37° C. Tissue samples and culture isolates with primers specific for M. tuberculosis and M. bovis were subjected to PCR. In total, 69 tissue samples of cattle were analyzed, 81.2% of which consisted of lymph nodes. Taking the combined results of cultures as the gold standard, the presence of mycobacteria was identified in 17 (24.6%) tissue samples, of which 12 (70.6%) belonged to the Mycobacterium tuberculosis complex (MTB complex), and 5 (29.4%) were identified as nontuberculous mycobacteria (NTM). The best diagnostic yield was achieved by Ogawa-Kudoh specific culture with Pyruvate and decontamination. The yield of PCR performed on tissue samples with the hsp65 gene as the target compared with the gold standard showed a sensitivity of 17.6% (95% CI: -0.005-0.36), specificity of 98.1% (95% CI: 0.94-1.02), positive predictive value of 75% (95% CI: 0.33-1.17), negative predictive value of 78.5% (95% CI: 0.68-1.19), and accuracy of 78.3%. The positive likelihood ratio was 9.18, and the negative likelihood ratio was 0.8. The hsp65 PCR performed directly on the affected tissue showed high specificity and positive predictive value, but low sensitivity. Optimization of this technique is highly desirable, so it can be used for laboratory routine monitoring.

A fim de pesquisar a presença de yersinia pseudotuberculosis em quadro de diarreia bovina, foram analisadas 220 amostras de fezes, 60 conteudos de intestino delgado e 56 conteudos de intestino grosso. Obteve-se isolamento positivo em 46 (21%), 9 (15%) e 5 (9%) das amostras respectivamente, totalizando 60 cepas do microrganismo. As 60 cepas de yersinia pseudotuberculosis pertenciam ao sorogrupo o iii., Apresentando identica sensibilidade aos antibioticos e quimioterapicos quando testados in vitro. Estatisticamente comprovou-se haver relação entre os isolamentos das cepas de yersinia pseudotuberculosis e os meses mais frios do ano. A cepa y. Pseudotuberculosis mostrou-se patogenica aos cobaios, quando administrada via oral. Apesar dos resultados bacteriologicos negativos, não se descartou a possibilidade do envolvimento de roedores silvestres e comensais na transmissão do microrganismo aos bovinos, podendo os proprios bovinos ou o solo, servirem como reservatorios do microrganismo. A metodologia utilizada no isolamento das cepas de y. Pseudotuberculosis possibilitou que 73,3% das mesmas fossem isoladas no cultivo primario e 26,66% apos o crioenriquecimento na temperatura de 4 GRAUS c por 7, 14 e 21 dias. / The main purposes of this research was to search for Yersinia pseudotuberculosis in faecal samples from bovine with diarrhea, from farms in the State of Paraná. We have analyzed 220 faecal samples, 60 samples from small intestine contents and 56 samples from large intestine contents. Yersinia pseudotuberculosis isolation was positive in 46 (21%), 9 (15%) and 5 (9%), respectively, totalizing 60 strains of the microrganism. The 60 strains of Yersinia pseudotuberculosis belong to serogroup 0 III, and they shown identical sensibility to antibiotics and other drugs, when tested in vitro. Through the statistical methods, X2 test, we found a positive correlation between Yersinia pseudotuberculosis isolation and the winter season. To establish the morbidity and mortality rates, cattle population was separated into three age related categories, wich are: calfs, yearlings and adults. In 1987 and 1988, the morbidity rates were 0%, 10,3% and 6,7%; 0%, 13,4% and 11,7%, respectively. In relation to mortality rates, they were 0%, 1,0% and 2,6% in 1987, and 0%, 2,1% and 2,6% in 1988. The strains of Yersinia pseudotuberculosis placed on serogroup 0 III, were pathogenic to guinea pigs, when giver per-os. We didn\'t get any isolation of Yersinia pseudotuberculosis from wild rodents and others, but we still think that may be incriminated in the transmission of the microrganism to bovines, although the bovines as well as the soil, may function as reservoires of the bacteria. Isolation of Yersinia pseudotuberculosis in primary cultures was possible in 73,33% although 26,66% of the isolations were successfull only after cold-temperature enrichment, with incubation at 4 C for 7, 14 an 21 days.

A fim de pesquisar a presença de yersinia pseudotuberculosis em quadro de diarreia bovina, foram analisadas 220 amostras de fezes, 60 conteudos de intestino delgado e 56 conteudos de intestino grosso. Obteve-se isolamento positivo em 46 (21%), 9 (15%) e 5 (9%) das amostras respectivamente, totalizando 60 cepas do microrganismo. As 60 cepas de yersinia pseudotuberculosis pertenciam ao sorogrupo o iii., Apresentando identica sensibilidade aos antibioticos e quimioterapicos quando testados in vitro. Estatisticamente comprovou-se haver relação entre os isolamentos das cepas de yersinia pseudotuberculosis e os meses mais frios do ano. A cepa y. Pseudotuberculosis mostrou-se patogenica aos cobaios, quando administrada via oral. Apesar dos resultados bacteriologicos negativos, não se descartou a possibilidade do envolvimento de roedores silvestres e comensais na transmissão do microrganismo aos bovinos, podendo os proprios bovinos ou o solo, servirem como reservatorios do microrganismo. A metodologia utilizada no isolamento das cepas de y. Pseudotuberculosis possibilitou que 73,3% das mesmas fossem isoladas no cultivo primario e 26,66% apos o crioenriquecimento na temperatura de 4 GRAUS c por 7, 14 e 21 dias. / The main purposes of this research was to search for Yersinia pseudotuberculosis in faecal samples from bovine with diarrhea, from farms in the State of Paraná. We have analyzed 220 faecal samples, 60 samples from small intestine contents and 56 samples from large intestine contents. Yersinia pseudotuberculosis isolation was positive in 46 (21%), 9 (15%) and 5 (9%), respectively, totalizing 60 strains of the microrganism. The 60 strains of Yersinia pseudotuberculosis belong to serogroup 0 III, and they shown identical sensibility to antibiotics and other drugs, when tested in vitro. Through the statistical methods, X2 test, we found a positive correlation between Yersinia pseudotuberculosis isolation and the winter season. To establish the morbidity and mortality rates, cattle population was separated into three age related categories, wich are: calfs, yearlings and adults. In 1987 and 1988, the morbidity rates were 0%, 10,3% and 6,7%; 0%, 13,4% and 11,7%, respectively. In relation to mortality rates, they were 0%, 1,0% and 2,6% in 1987, and 0%, 2,1% and 2,6% in 1988. The strains of Yersinia pseudotuberculosis placed on serogroup 0 III, were pathogenic to guinea pigs, when giver per-os. We didn\'t get any isolation of Yersinia pseudotuberculosis from wild rodents and others, but we still think that may be incriminated in the transmission of the microrganism to bovines, although the bovines as well as the soil, may function as reservoires of the bacteria. Isolation of Yersinia pseudotuberculosis in primary cultures was possible in 73,33% although 26,66% of the isolations were successfull only after cold-temperature enrichment, with incubation at 4 C for 7, 14 an 21 days.

Submitted by LUCAS HIDENORI OKAMURA null (okamura.lh@gmail.com) on 2017-03-13T01:38:38Z No. of bitstreams: 1 Tese - Okamura LH.pdf: 16867432 bytes, checksum: 3ff6041b8c167ca16d68fd929bd4a69e (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-03-17T17:28:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 okamura_lh_dr_sjrp.pdf: 16867432 bytes, checksum: 3ff6041b8c167ca16d68fd929bd4a69e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-17T17:28:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 okamura_lh_dr_sjrp.pdf: 16867432 bytes, checksum: 3ff6041b8c167ca16d68fd929bd4a69e (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O Brasil possui um dos maiores rebanhos de bovinos mundialmente. Estes animais estão expostos constantemente a agentes virais causadores de patologias. Dentre estes, o herpesvírus bovino 1 (BHV1) e 5 (BHV5) apresentam grande importância epidemiológica. O BHV1 causa infecções respiratórias e genitais, enquanto que o BHV5 meningoencefalite. As proteínas de membrana presentes nos herpesvírus os tornam capazes de infectar as células do hospedeiro. Com afinidade a distintas células, desenvolvem sua capacidade de infecção, apresentam mecanismos de sobrevivência à morte celular programada e a resposta imunológica. As interações vírus-hospedeiro são fundamentais no entendimento de aspectos relacionados a transmissão viral, capacidade de infecção e progressão da doença. Para este fim, se faz necessário compreender elementos fundamentais, como a modulação da função mitocondrial e a replicação do BHV, bem como os níveis de apoptose nas células do hospedeiro. De igual importância, é indispensável entender o comportamento de genes apoptóticos que estão relacionados à infecção por BHV5 e seus envolvimentos na viabilidade celular. Estes achados contribuem para o entendimento da imunopatogenia do BHV, auxiliam a evitar a disseminação destes agentes e são de grande valia para o desenvolvimento de vacinas. / Brazil has one of the largest cattle hers worldwide. These animals are constantly exposed to pathological viral agents. Bovine herpesvirus 1 (BHV1) and BHV5 have great epidemiological importance. BHV1 is causative agent of respiratory and genital infections, while BHV5 causes meningoencephalitis. Herpesvirus membrane proteins allow them to infect the host cells. They present affinity to different types of cells, develop mechanisms to survive programmed cell death, and immune response. Virus-host interactions are essential to understand aspects related to viral transmission, capacity of infection and disease progression. To this end, it is necessary to understand the fundamental elements related to the modulation of mitochondrial function and replication of BHV, as well as apoptosis levels in the host cells. It is crucial to understand the behavior of apoptotic genes related to BHV5 infection and cell viability. These findings contribute to understanding the BHV immunopathogenesis, help to prevent the spread of these agents, and are of great value to the development of vaccines.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-11-18T09:04:50Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 658681 bytes, checksum: 11991dd14f8b7cdea12ab42eb1a397f1 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-18T09:04:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 658681 bytes, checksum: 11991dd14f8b7cdea12ab42eb1a397f1 (MD5) Previous issue date: 2015-07-21 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Listeria monocytogenes pode contaminar produtos cárneos principalmente através de contaminação cruzada de utensílios expostos a produtos crus. A qualidade destes produtos pode ser ainda estimada através da pesquisa de micro-organismos indicadores de higiene, o que não isenta a pesquisa de patógenos para garantia de inocuidade. A contaminação por L. monocytogenes em ambientes de processamento de alimentos é de difícil controle, devido a sua ampla disseminação e adaptação, o que demanda monitoramento constante e adoção de procedimentos eficientes para eliminação desse patógeno. A primeira etapa deste trabalho identificou as principais fontes de contaminação microbiológica no ambiente de processamento de três açougues, quando amostras superfíciais foram obtidas de mesas, facas, interior do balcão refrigeração, moedores e amaciadores de carne (20 amostras por área) e submetidas à enumeração de micro-organismos indicadores de higiene, e pesquisa de L. monocytogenes, cujos isolados obtidos foram caracterizados quanto aos seus sorogrupos e genes de virulência. Os resultados demostraram que não houve diferenças nos níveis de contaminação por micro-organismos indicadores de higiene entre os três estabelecimentos analisados; as amostras com contagens acima de valores referenciais indicaram ineficiêncianos procedimentos de higienização praticados. 87 amostras apresentaram resultado positivo para Listeria spp. (60,4 %), sendo 22 amostras de mesa, 20 de moedor, 16 de faca, 13 de mão, 9 de amaciador e 7 do balcão de refrigeração. Um total de 31 amostras (21,5 %) foram positivas para L. monocytogenes, indicando a presença do patógeno no ambiente de processamento de produtos cárneos. Na caracterização dos sorotipos, 52 isolados foram caracterizados como pertencentes aos sorogrupos 1/2c ou 3c, e 22 isolados como pertencentes aos sorogrupos 4b, 4d, 4a ou 4c. Na pesquisa dos genes de virulência, todos os 74 isolados apresentaram resultados positivos para os genes hlyA, iap,plcA, actA e para o grupo das internalinas (inlA, inlB, inlC e inlJ). Na segunda etapa do estudo,foi avaliado a ocorrência de L. monocytogenes (ISO 11.290 1/2) em utensílios e ambiente de manipulação em um açougue, e os isolados obtidos foram caracterizados quanto aos seus sorogrupos e genes de virulência e ainda avaliados quanto à capacidade de adesão in vitro e sensibilidade a dois sanitizantes (Mister Max-DG1 ® e B-QUART SEPT ®). Do total de 40 amostras de mesas, facas, interior do balcão refrigeração, moedores e amaciadores de carne, 75 % foram positivas para Listeria spp. e 22,5 % para L. monocytogenes. Todos os isolados obtidos foram caracterizados como sorogrupos 1/2c ou 3c, e apresentaram resultados positivos para todos os genes de virulência analisados. Adicionalmente, todos os isolados apresentaram algum potencial de adesão, em sua maioria apresentando potenciais de adesão variando de fraco a moderado, sendo que somente um isolado apresentou um forte potencial de adesão. Os sanitizantes avaliados apresentaram potencial para inibir da multiplicação dos isolados em diferentes concentrações (1:256 a 1:512 para Mister Max-DG1 ®, e 1:4.096 a 1:16.384 para B- QUART SEPT ®), e interferiram na formação e remoção de biofilmes pelos isolados. Após avaliação, os sanitizantes foram adotados na rotina de higienização do estabelecimento comercial, e após 2 meses, amostras superficiais dos mesmos utensílios e equipamentos foram coletadas e submetidas a análise de L. monocytogenes, e nenhum resultado positivo foi identificado. Os resultados obtidos permitiram caracterizar os sorugrupos dos isolados de L. monocytogenes obtidos bem como a o seu potencial virulento, foi também demostrado o potencial de adesão de L. monocytogenes e a eficiência dos sanitizantes Mister Max-DG1 ® e B-QUART SEPT ® para o controle da contaminação por esse patógeno. Os resultados indicam que o estabelecimento de procedimentos adequados para redução das contagens microbianas e controle da disseminação de L. monocytogenes nas etapas finais da cadeia produtiva da carne é de extrema importância, com reflexos evidentes na qualidade e inocuidade dos produtos cárneos destinados ao consumo humano. Adicionalmente, verificou-se o potencial de adesão de L. monocytogenes e a eficiência dos sanitizantes Mister Max-DG1 ® e B- QUART SEPT ® para o controle da contaminação superficial por esse patógeno. / Listeria monocytogenes can contaminate meat products primarily through cross- contamination of utensils exposed to raw products. The quality of these products can still be estimated through the research of hygiene indicator microorganisms, which does not exclude the research of pathogens to assure the food safety. Contamination by L. monocytogenes in food processing environments is difficult to control due to its wide dissemination and adaptation, which requires constant monitoring and adoption of efficient procedures to eliminate this pathogen. In the first step of this study, we identified the main sources of microbiological contamination in three butchers processing environment by collecting surface samples from the hands of employees, tables, knives, inner of butcher display, grinders and meat tenderizers (24 samples per area). Samples were subjected toenumeration of hygiene indicator microorganisms and detection of L. monocytogenes, being the isolates characterized for their virulence genes and serogroups. The results demonstrated absence of differences in the levels of contamination by hygiene indicators microorganisms analyzed between the three butcher shops; samples with counts higher than reference values indicated inefficiency in practiced hygiene procedures. 87 samples were positive for Listeria spp. (60.4 %), being 22 samples from table, 20 from grinders, 16 from knives, 13 from hands, 9 from meat tenderizers and 7 from the inner of butcher display. 31 samples (21.5 %) were positive for L. monocytogenes, indicating the presence of the pathogen in meat processing environment. 52 isolates were characterized as belonging to serogroup 1/2c or 3c, and 22 isolates belonged to serogroups 4b, 4d, 4a or 4c. All 74 isolates showed positive results for hlyA genes, iap, plcA, actA and the group of internalins (InlA, inlB, inLC and inlJ). In the second step of the study, we evaluated the occurrence of L. monocytogenes in the processing environment of a butcher shop, and the obtained isolates were isolates were characterized as to their serogroups and virulence genes and further evaluated for in vitro adhesion capacity sensitivity to two sanitizers (Mister Max-DG1 ® and B-QUART SEPT ®). Of the total of 40 samples hands of manipulators, tables, knives, inner of butcher display, grinders and meat tenderizers, 75 % were positive for Listeria spp. and 22,5 % for L. monocytogenes. All isolates were characterized as belonging to serogroup 1/2c or 3c, and showed positive results for all virulence genes analyzed. In addition, all isolates showed some potential of adhesion, mostly presenting potential of adhesion ranging from weak to moderate, and only one isolate showed a strong potential. The evaluated sanitizers had potential to inhibit the multiplication of isolates in different concentrations (1: 256-1: 512 for Mister Max-DG1 ® , and 1: 4096-1: 16,384 for B-QUART SEPT ®) , and interfered in the formation and removal of the biofilms. After evaluation, the sanitizers were adoptedby the butcher shop cleaning routine, and after two months surface samples from the same utensils and equipment were collected and subjected to L. monocytogenes analysis, and no positive result was identified. The results allowed to characterize the sorugrupos of L. monocytogenes isolates obtained as well as their virulent potential, it has also demonstrated the potential of adhesion of L. monocytogenes and the effectiveness of sanitizers Mister Max-DG1 ® and B-QUART SEPT ® to control contamination by this pathogen. Results indicate that the establishment of appropriate procedures to reduce microbial counts and controlling the spread of L. monocytogenes in the final stages of meat production chain is of utmost importance, with obvious effects on the quality and safety of meat products for human consumption. Additionally, it was found L. monocytogenes adhesion potential and the efficiency of the sanitizing Mister Max- DG1 ® and B -quart SEPT ® for the control of surface contamination by these pathogens.

Apesar da comprovada capacidade de melhorar o desempenho de suínos, o uso de antimicrobianos como promotores do crescimento vem sendo progressivamente restringido em diversos países. As novas regulamentações têm forçado a procura por alternativas ao uso de antibióticos e quimioterápicos como promotores do crescimento de suínos. Os extratos vegetais constituem uma dessas alternativas pesquisadas. Sendo assim, o objetivo do trabalho foi avaliar os efeitos de antimicrobianos e extratos vegetais sobre a digestibilidade aparente dos nutrientes, desempenho, morfometria dos órgãos, histologia do epitélio intestinal, microbiologia intestinal e frequência de diarréia de leitões recém-desmamados. Foram realizados três experimentos em blocos casualizados, nos quais foram testados, durante 35 dias, cinco tratamentos: controle - ração basal; antimicrobiano - basal com bacitracina de zinco, olaquindox e colistina (50 ppm de cada); extrato vegetal A, B e C - basal com 700, 1200 e 2100 ppm de extrato vegetal, respectivamente. O extrato vegetal foi constituído de quantidades iguais de óleo essencial de cravo, tomilho, orégano, eugenol e carvacrol. Foram utilizados 40 leitões em cada experimento, com idades iniciais e finais de, respectivamente, 21 e 56 dias. Foram alocados dois leitões (um macho castrado e uma fêmea) em cada baia (unidade experimental). No ensaio de digestibilidade (Experimento I) utilizou-se o método da coleta parcial de fezes, tendo o óxido crômico (Cr2O3) como marcador. Ao final do Experimento I, um animal de cada unidade experimental foi abatido para análise de morfometria dos órgãos e coleta de amostras do epitélio intestinal para análise histológica e microbiológica. Nos Experimentos I, II e III, foram medidas a frequência de diarréia e as variáveis de desempenho. A digestibilidade da matéria seca foi maior (P<0,05) para o tratamento com extratos vegetais em relação ao tratamento controle e com antimicrobianos. Durante os períodos de 1 a 14 e 1 a 35 dias de experimentação, o tratamento antimicrobiano apresentou melhores resultados (P<0,05) de peso vivo, consumo diário de ração e ganho diário de peso que os demais tratamentos. Dentre os níveis de extratos vegetais, o maior nível de inclusão foi o que proporcionou melhores resultados de desempenho. Na análise de morfometria dos órgãos, foram encontradas diferenças (P<0,05) entre os tratamentos apenas para o peso relativo do trato gastrintestinal total e do intestino delgado vazio, sendo que os melhores (menores) resultados foram obtidos para os animais suplementados com antimicrobianos. Para a histologia do epitélio intestinal, novamente os melhores resultados foram obtidos para o tratamento com antimicrobianos, tendo apresentado maior altura de vilosidade (P<0,05) e menor relação altura de vilosidade e profundidade de cripta do íleo que os tratamentos com extratos vegetais. Não foram encontradas diferenças significativas (P>0,05) para os resultados de microbiologia intestinal. A frequência de diarréia dos animais que receberam antimicrobianos foi inferior (P<0,05) àquela do tratamento controle ou extratos vegetais no período de 1 a 35 dias de experimentação, indicando eficácia dos antimicrobianos em controlar a diarréia. Os extratos vegetais apresentaram resultados intermediários entre o tratamento controle e com antimicrobianos para essa variável. / The use of antimicrobials as growth promoters of swine has been gradually restricted in many countries. The new regulations have forced the search for alternatives to the antibiotic use as growth promoters for swine. The herbal extracts are one of these alternatives. The purpose of this work was to evaluate the antimicrobial agents and herbal extracts as growth promoters, based on intestinal morphology, histology, microbiology, digestibility, fecal score, and on performance of weanling pigs. Three randomized complete block design experiments were carried out to compare five treatments: control - basal diet; antimicrobial - basal diet plus Zn bacitracin, olaquindox, and colistin (50 ppm of each); herbal extract A, B and C - basal diet plus 700 ppm, 1200 ppm and 2100 ppm of herbal extract, respectively. The herbal extract consisted of a mixture of equal amounts of essential oils of thyme, clove, oregano, eugenol and carvacrol. In each Experiment, forty 21-d-weaned pigs were allotted to 20 suspended pens, with two pigs (a castrated male and a female) per pen (experimental unit) and four replications per treatment. Digestibility assay (Experiment I) was conducted using chromic oxide (Cr2O3) as fecal marker. On 35th day of experimental period, an animal of each experimental unit was slaughtered for morphological analysis and samples of the intestine epithelium were collected for histological and microbiological analysis. Performance data and fecal score of pigs were collected from Experiments I, II and III. The herbal extracts increased (P<.05) the dry matter apparent digestibility of the diet compared to control and antimicrobial treatments. The antimicrobial agents improved (P<.05) body weight, feed intake and average daily gain of weanling pigs during 1 to 14 and 1 to 35 days of experimental period compared to control and herbal extract. Among all levels of herbal extract, higher levels showed better performance results. The antimicrobial treatment improved the relative weights of the intestinal tract and empty small intestine (P<.05) and improved ileum villus height and the ratio of ileum villus height:crypt depth of animals. There was no statistical difference (P>.05) in microbiological analysis. During 1 to 35 days of experimental period, incidence of diarrhoea of pigs fed antimicrobials was statisticaly lower (P<.05) than those fed control or herbal extract diet, suggesting the efficacy of antimicrobials in diarrhoea control. Pigs fed herbal extract showed intermediary results between antimicrobial and control diets for this variable.

Apesar da comprovada capacidade de melhorar o desempenho de suínos, o uso de antimicrobianos como promotores do crescimento vem sendo progressivamente restringido em diversos países. As novas regulamentações têm forçado a procura por alternativas ao uso de antibióticos e quimioterápicos como promotores do crescimento de suínos. Os extratos vegetais constituem uma dessas alternativas pesquisadas. Sendo assim, o objetivo do trabalho foi avaliar os efeitos de antimicrobianos e extratos vegetais sobre a digestibilidade aparente dos nutrientes, desempenho, morfometria dos órgãos, histologia do epitélio intestinal, microbiologia intestinal e frequência de diarréia de leitões recém-desmamados. Foram realizados três experimentos em blocos casualizados, nos quais foram testados, durante 35 dias, cinco tratamentos: controle - ração basal; antimicrobiano - basal com bacitracina de zinco, olaquindox e colistina (50 ppm de cada); extrato vegetal A, B e C - basal com 700, 1200 e 2100 ppm de extrato vegetal, respectivamente. O extrato vegetal foi constituído de quantidades iguais de óleo essencial de cravo, tomilho, orégano, eugenol e carvacrol. Foram utilizados 40 leitões em cada experimento, com idades iniciais e finais de, respectivamente, 21 e 56 dias. Foram alocados dois leitões (um macho castrado e uma fêmea) em cada baia (unidade experimental). No ensaio de digestibilidade (Experimento I) utilizou-se o método da coleta parcial de fezes, tendo o óxido crômico (Cr2O3) como marcador. Ao final do Experimento I, um animal de cada unidade experimental foi abatido para análise de morfometria dos órgãos e coleta de amostras do epitélio intestinal para análise histológica e microbiológica. Nos Experimentos I, II e III, foram medidas a frequência de diarréia e as variáveis de desempenho. A digestibilidade da matéria seca foi maior (P<0,05) para o tratamento com extratos vegetais em relação ao tratamento controle e com antimicrobianos. Durante os períodos de 1 a 14 e 1 a 35 dias de experimentação, o tratamento antimicrobiano apresentou melhores resultados (P<0,05) de peso vivo, consumo diário de ração e ganho diário de peso que os demais tratamentos. Dentre os níveis de extratos vegetais, o maior nível de inclusão foi o que proporcionou melhores resultados de desempenho. Na análise de morfometria dos órgãos, foram encontradas diferenças (P<0,05) entre os tratamentos apenas para o peso relativo do trato gastrintestinal total e do intestino delgado vazio, sendo que os melhores (menores) resultados foram obtidos para os animais suplementados com antimicrobianos. Para a histologia do epitélio intestinal, novamente os melhores resultados foram obtidos para o tratamento com antimicrobianos, tendo apresentado maior altura de vilosidade (P<0,05) e menor relação altura de vilosidade e profundidade de cripta do íleo que os tratamentos com extratos vegetais. Não foram encontradas diferenças significativas (P>0,05) para os resultados de microbiologia intestinal. A frequência de diarréia dos animais que receberam antimicrobianos foi inferior (P<0,05) àquela do tratamento controle ou extratos vegetais no período de 1 a 35 dias de experimentação, indicando eficácia dos antimicrobianos em controlar a diarréia. Os extratos vegetais apresentaram resultados intermediários entre o tratamento controle e com antimicrobianos para essa variável. / The use of antimicrobials as growth promoters of swine has been gradually restricted in many countries. The new regulations have forced the search for alternatives to the antibiotic use as growth promoters for swine. The herbal extracts are one of these alternatives. The purpose of this work was to evaluate the antimicrobial agents and herbal extracts as growth promoters, based on intestinal morphology, histology, microbiology, digestibility, fecal score, and on performance of weanling pigs. Three randomized complete block design experiments were carried out to compare five treatments: control - basal diet; antimicrobial - basal diet plus Zn bacitracin, olaquindox, and colistin (50 ppm of each); herbal extract A, B and C - basal diet plus 700 ppm, 1200 ppm and 2100 ppm of herbal extract, respectively. The herbal extract consisted of a mixture of equal amounts of essential oils of thyme, clove, oregano, eugenol and carvacrol. In each Experiment, forty 21-d-weaned pigs were allotted to 20 suspended pens, with two pigs (a castrated male and a female) per pen (experimental unit) and four replications per treatment. Digestibility assay (Experiment I) was conducted using chromic oxide (Cr2O3) as fecal marker. On 35th day of experimental period, an animal of each experimental unit was slaughtered for morphological analysis and samples of the intestine epithelium were collected for histological and microbiological analysis. Performance data and fecal score of pigs were collected from Experiments I, II and III. The herbal extracts increased (P<.05) the dry matter apparent digestibility of the diet compared to control and antimicrobial treatments. The antimicrobial agents improved (P<.05) body weight, feed intake and average daily gain of weanling pigs during 1 to 14 and 1 to 35 days of experimental period compared to control and herbal extract. Among all levels of herbal extract, higher levels showed better performance results. The antimicrobial treatment improved the relative weights of the intestinal tract and empty small intestine (P<.05) and improved ileum villus height and the ratio of ileum villus height:crypt depth of animals. There was no statistical difference (P>.05) in microbiological analysis. During 1 to 35 days of experimental period, incidence of diarrhoea of pigs fed antimicrobials was statisticaly lower (P<.05) than those fed control or herbal extract diet, suggesting the efficacy of antimicrobials in diarrhoea control. Pigs fed herbal extract showed intermediary results between antimicrobial and control diets for this variable.