Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-11-06T10:14:45Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1239459 bytes, checksum: e1a7cd2486c370dcab988719055849df (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-06T10:14:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1239459 bytes, checksum: e1a7cd2486c370dcab988719055849df (MD5) Previous issue date: 2017-06-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A utilização de cepas fermentadoras de Lactococcus lactis subsp. lactis produtoras de nisina em alimentos fermentados tem vantagem para a indústria pois permite um controle adicional de contaminantes, como o patógeno de origem alimentar Listeria monocytogenes. No entanto, as interações microbianas devem ser avaliadas para garantir a produção da bacteriocina no alimento e o efeito na população do patógeno. L. monocytogenes tem a capacidade de resistir a diversas condições de estresse encontradas no alimento e durante o processamento, expressando diferentes genes como o fator siga alternativo (sigB), a enzima glutamato descarboxilase (gadD), a chaperona GroEL e o transportador de glicina betaína (gbu). A exposição a uma condição de estresse em nível subletal é capaz de conferir uma maior resistência a L. monocytogenes de sobreviver a outras situações. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de genes de estresse de L. monocytogenes em interação com L. lactis subsp. lactis produtor de nisina em meio de cultura e leite. A produção de nisina em caldo BHI e leite foi avaliada por sua detecção no sobrenadante do meio de crescimento e pela expressão do gene nisK. A expressão dos genes de estresse de L. monocytogenes sigB, gadD2, groEL e gbu foi avaliada relativamente a cultura pura e na interação com L. lactis subsp. lactis. A expressão relativa dos genes de estresse de L. monocytogenes foi variável. No entanto, a expressão dos genes sigB, groEL e gbu foi inferior no tempo de 24 h durante a interação, em relação a cultura pura, o que pode indicar uma menor capacidade de sobrevivência aos estresses quando a bactéria se encontra em interação com L. lactis subsp. lactis produtor de nisina. / The use of nisin producing fermentative strains of Lactococcus lactis subsp. lactis in fermented foods has an advantage for the industry because it allows an additional control of contaminants, such as the food-borne pathogen Listeria monocytogenes. However, microbial interactions should be evaluated to ensure bacteriocin production in the food and the effect on the pathogen population. L. monocytogenes has the ability to withstand the various stress conditions encountered in food and during processing, expressing different genes such as the alternative sigma factor (sigB), the glutamate decarboxylase enzyme (gadD), the GroEL chaperone and the glycine betaine transporter (gbu). The exposure to a stress condition at the sublethal level is able to confer a greater resistance to L. monocytogenes to survive other situations. In this context, the aim of this work was to evaluate the expression of L. monocytogenes stress genes in interaction with nisin producing L. lactis subsp. lactis in culture medium and milk. The production of nisin in BHI broth and milk was evaluated by its detection in the supernatant of the growth medium and by the expression of the nisK gene. Expression of sigB, gadD2, groEL and gbu stress genes of L. monocytogenes was evaluated for pure culture and for the interaction with L. lactis subsp. lactis. The relative expression of the L. monocytogenes stress genes was variable. However, expression of the sigB, groEL and gbu genes was lower at 24 h during interaction than in pure culture, which may indicate a lower ability to survive stress when the bacterium is interacting with nisin producing L. lactis subsp. lactis.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-28T16:55:13Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1163157 bytes, checksum: 3778d489d49b57163f5cb7d9bcbc68f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-28T16:55:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1163157 bytes, checksum: 3778d489d49b57163f5cb7d9bcbc68f2 (MD5) Previous issue date: 2017-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A carne suína é um dos produtos de origem animal mais consumido no mundo. O Brasil tem destaque nesse cenário, já que está entre os principais países produtores de suínos e com grande potencial de exportação dos produtos derivados da carne suína, além de um grande mercado interno para ser explorado. A pesquisa de Yersinia enterocolitica é extremamente importante nessa cadeia produtiva, por estar frequentemente associada a esses animais. No homem, Y. enterocolitica causa uma gastroenterite denominada yersiniose, que se caracteriza por diarreia aguda e febre (principalmente em crianças), dor abdominal, linfadenite mesentérica aguda simulando apendicite, com complicações em alguns casos como eritema nodoso, artrite pós-infecciosa e infecção sistêmica. O objetivo desse trabalho foi realizar o rastreamento da contaminação por Y. enterocolitica na cadeia produtiva de carne suína, assim como caracterizar o potencial patogênico e perfil de resistência a antimicrobianos dos isolados. Amostras das baias e de diferentes etapas do abate de suínos e do processamento de carne suína (ambiente, carcaças, tonsilas palatinas, linfonodos mesentéricos, utensílios, equipamentos e produtos finais; n = 870) foram obtidas de duas granjas de criação de suínos em fase de terminação e de um matadouro-frigorífico localizados na região de Viçosa, Minas Gerais, Brasil. As amostras foram submetidas à detecção de Y. enterocolitica conforme ISO 10273:2003 e os isolados obtidos foram submetidos sorotipagem. a testes Os fenotípicos isolados e moleculares identificados como Y. para identificação enterocolitica e foram submetidos a macro-restrição com XbaI e eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), a reações de PCR para detecção de genes associados a patogenicidade, e caracterizados quanto ao seu perfil de resistência a 17 antimicrobianos, pela técnica do breakpoint e por PCR. Y. enterotocolitica foi identificado em 8 amostras, sendo cinco de tonsilas palatinas, duas de linfonodos mesentéricos e uma de carcaça suína após a sangria, das quais foram obtidos 16 isolados. Todos os isolados foram identificados como pertencentes ao bio-sorotipo 4/O:3, envolvido em vários surtos de yersiniose pelo mundo. Considerando os perfis genéticos obtidos por PFGE, os isolados apresentaram identidade entre 60% e 80%, demonstrando o alto grau de indentidade, além de identificação de tonsilas palatinas como potencial fonte de contaminação. Vários genes de virulência relevantes para a patogenicidade de Y. enterotocolitica foram detectados nos isolados. Todos os isolados apresentaram altas frequências de resistência a antimicrobianos (15 substâncias), além da presença dos genes emrD, yfhD e marC, relacionados a resistência múltipla a antimicrobianos. Os isolados apresentaram sensibilidade apenas a ciprofloxacina e kanamicina. Esse estudo demonstrou a importância dos suínos na disseminação de Y. enterotocolitica na cadeia produtiva de carne suína, ressaltando a importância do controle e monitoramento desse patógeno nas etapas iniciais da produção, que deve ser realizado com auxílio das ferramentas disponíveis atualmente, para a garantia de um alimento inócuo e de qualidade. / Pork is the main animal origin protein consumed around the world, and Brazil is one of the main world producer of swines, presenting a large potential for exportation and consumption of pork products. Yersinia enterocolitica is a relevant foodborne pathogen in pork products, once swines are reservoirs of this pathogen and work as sources of contamination in slaughterhouses. Y. enterocolitica is responsible for human yersiniosis, a gastroenteritis that causes acute diarrhea and fever (especially in children), abdominal pain, acute mesenteric lymphadenitis, mimicking appendicitis, with complications in some cases as erythema nodosum, post-infectious arthritis and septicemia. This study aimed the tracking of Y. enterocolitica contamination in the pork production chain, and to characterize the pathogenic potential and antimicrobial resistance profiles of isolates. Samples from different steps of pork production (environment, carcasses, palatine tonsils, mesenteric lymph nodes, utensils, equipment, and end products; n = 870) were obtained from two finishing pig farms and one slaughterhouse located in Viçosa region, Minas Gerais, Brazil. Samples were subjected to Y. enterocolitica detection according ISO 10273:2003, and the obtained isolates were subjected to phenotypical and molecular analysis for identification and serotyping. Y. enterocolitica isolates were subjected to XbaI macrorestriction and pulsed filed gel electrophoresis (PFGE), PCR to detect virulence related genes, and to breakpoint and PCR to characterize their antimicrobial resistance profiles against 17 substances. Y. enterocolitica was isolated in 8 samples, specifically palatine tonsils (5), mesenteric lymph nodes (2) and carcasses after bleeding (1), and 16 isolates were obtained. All isolates were identified as belonging to bio-serotype 4/O:3, associated to various yersiniosis cases and outbreaks around the world. PFGE demonstrated 60 to 80% identify indexes among isolates, and alloed the identification of palatine tonsils as relevant contamination sources in the pork production chain. The isolates presented different virulence related genes, demonstrating the pathogenic potential of Y. enterocolitica. All isolates presented high frequencies of antimicrobial resistance (to 15 substances), despite the presence of emrD, yfhD and marC, related to multi-drug resistance. Only ciprofloxacin and kanamicin were effective agains all isolates. The present study demonstrated the relevance of swines in the distribuiton of Y. enterocolitica in the pork production chain, highlighting the need for proper control of contamination and tracking of this foodborne pathogen in the initial steps of production, what must be conducted with the support for available tools to assure the quality and safety of pork products.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-04-10T13:45:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 764542 bytes, checksum: 44a702a2ddb3596339acf378154c7d70 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-10T13:45:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 764542 bytes, checksum: 44a702a2ddb3596339acf378154c7d70 (MD5) Previous issue date: 2017-11-13 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A cadeia produtiva de carne suína está susceptível a diferentes fontes de contaminação microbiológica em diferentes etapas, desde a produção primária até o processamento de produtos finais. Considerando o contexto atual de comércio internacional de produtos, o controle de eventuais perigos microbiológicos deve ser efetivo, visando a inocuidade dos produtos finais e segurança do consumidor. Em relação a carne suína, Staphylococcus coagulase positiva (SCP) possui grande importância por serem importantes indicadores das condições de manipulação, e também por indicarem a presença de S. aureus, que na cadeia produtiva de suínos possui relevância pela possibilidade de carrear genes de resistência a diferentes antimicrobianos nos produtos finais e consumidores. O objetivo desse estudo foi rastrear a contaminação por SCP e S. aureus resistentes a antimicrobianos na cadeia produtiva de carne suína. Duas granjas de criação de suínos (ciclo completo) e um frigorífico foram selecionados para coleta de 603 amostras ao longo da cadeia produtiva de carne suína (1 - Granjas: baia de terminação, n = 18; 2 - Abate: carcaça após sangria, n = 90; carcaça após chamuscamento, n = 90; carcaça após evisceração, n = 90; carcaça após lavagem, n = 90; 3 - Processamento: faca limpa, n = 27; faca durante processamento, n = 27; mãos limpas, n = 27; mãos durante processamento, n = 27; mesa limpa, n = 27; mesa durante processamento, n = 27; 4 - Produtos finais: costela, n = 18; paleta, n = 18; pernil, n = 18; linguiça, n = 9), que foram submetidas a enumeração de SCP, e posterior isolamento e identificação de S. aureus. A contaminação por SCP foi inferior a 2 log UFC/cm2 ou g em 512 (84,9%) amostras, entre 2 e 3 logs UFC/cm2 ou g em 52 (8,6%) amostras, entre 3 e 4 logs UFC/cm2 ou g em 6 (1,0%) amostras, e superior a 4 log UFC/cm2 ou g em 33 (5,5%) amostras. Contagens superiores a 4 log UFC/cm2 ou g foram observadas em baias de terminação, carcaças após evisceração, carcaças após lavagem, facas limpas, mesas limpas, costela e linguiças. A enumeração de SCP foi possível em 197 (32,7%) amostras, e as contagens médias variaram entre 1,0 log UFC/cm2 (mesa durante processamento) e 5,2 logs UFC/cm2 (baia de terminação). Considerando as diferentes etapas de processamento, não foram observadas diferenças significativas entre as amostras obtidas no ambiente de processamento e nos produtos finais (p > 0,05). Durante o abate, as contagens médias de SCP obtidas nas carcaças após sangria foram superiores quando comparadas as etapas posteriores (p > 0,05). Um total de 315 colônias de SCP foi selecionado e caracterizado quanto ao perfil bioquímico e presença do gene femA para identificação de S. aureus. Assim, 246 isolados de S. aureus foram identificados e submetidos a caracterização de seus perfis de resistência em relação a 11 antimicrobianos, por testes de susceptibilidade e pela pesquisa de genes relacionados a resistência. Considerando os resultados fenotípicos, 90,7% dos isolados de S. aureus apresentaram resistência a sulfamethoxazole (SUL), 87,0% a ciprofloxacina (CIP), 67,9% a penicilina (PEN), 49,6% a eritromicina (ERI), 40,2% a oxacilina (OXA), 40,2% a clindamicina (CLI), 29,3% a rifampicina (RIF), 28,5% a cloranfenicol (CLO), 21,1% a tetraciclina (TET), 16,3% a vancomicina (VAN) e 6,5% a gentamicina (GEN). Apenas 15 isolados foram susceptíveis a todos os antimicrobianos testados (isolados obtidos de baias de terminação, carcaças, pernil e linguiça), 7 a apenas um antimicrobiano (CIP, SUL ou TET), e os demais resistentes simultaneamente a 2 a 10 diferentes antimicrobianos; o perfil de resistência a PEN-ERI-CIP-SUL foi o que apresentou maior frequência entre os isolados de S. aureus (n = 37). Em relação aos genes relacionados a resistência a diferentes antimicrobianos, 74,0% dos isolados de S. aureus apresentaram resultados positivos para blaZ (PEN), 8,1% para femB (OXA), e 3,7% para tetK (TET); não foram observados resultados positivos para vanA (VAN), mecA e mecC (OXA). Entre os isolados de S. aureus, 60 não apresentaram nenhum dos genes pesquisados, 164 apresentaram apenas um dos genes isolados (blaZ, femB e tetK), 15 apresentaram simultaneamente os genes femB-blaZ, 4 os genes blaZ-tetK, e 3 os genes femB-blaZ-tetK. Apenas em relação a TET foi verificado que o teste de susceptibilidade foi equivalente a presença de blaZ (p = 0,147), e ausência de equivalência de resultados para OXA (femA, femB), VAN (vanA) e TET (tetK) (p < 0,05). Os resultados obtidos demonstram a relevância de SCP como indicadores de manipulação e higiene na cadeia produtiva de carne suína, assim como a presença de S. aureus com resistência a diferentes antimicrobianos, alertando para a necessidade de monitoramento por metodologias fenotípicas e moleculares. / The pork production chain is susceptible to different sources of microbiological contamination at different stages, from primary production to the processing of final product. Regarding the current context of international trade in products, the control of possible microbiological hazards must be effective, aiming at the safety of final products and consumer. In relation to pork, Staphylococcus coagulase positive (SCP) is relevant because they are important indicators of the manipulation condition and also because they indicate the presence of S. aureus, which in the production chain of pigs has relevance due to the possibility of carrying resistance genes to different antimicrobials in the final products and consumers. The objective of this study was to track the contamination by SCP and S. aureus resistant to antimicrobial in the pork production chain. Two pig farms (complete cycle) and a refrigerator were selected to collect 603 samples through the pork production chain (1 - Farms: termination bay, n = 18; 2 - Slaughter: carcass after bleeding, n = 90; carcass after scorching, n = 90; carcass after evisceration, n = 90; carcass after washing, n = 90; 3 - Processing: clean knife, n = 27; knife during processing, n = 27; clean hands, n = 27; hands during processing, n = 27; clean table, n = 27; table during processing, n = 27; 4 - Final products: rib, n = 18; palette, n = 18; leg, n = 18; sausage, n = 9) which were submitted to SCP enumeration, subsequent isolation and identification of S. aureus. The SCP contamination was less than 2 log CFU / cm2 or g in 512 (84.9%) samples, between 2 and 3 log CFU / cm2 or g in 52 (8.6%) samples, between 3 and 4 CFU logs / cm2 or g in 6 (1.0%) samples, and greater than 4 log CFU / cm2 or g in 33 (5.5%) samples. Counts greater than 4 log CFU / cm2 or g were observed in termination bins, carcasses after evisceration, carcasses after washing, clean knives, clean tables, rib and sausages. SCP enumeration was possible in 197 (32.7%) samples, and the mean counts varied between 1.0 log CFU / cm2 (table during processing) and 5.2 log CFU / cm2 (termination bay). Considering the different steps of the process, no significant differences were observed between the obtained samples in the processing environment and in the final products (p> 0.05). During slaughter, the SCP mean counts obtained on carcasses after bleeding were higher when compared to the later stages (p> 0.05). A total of 315 SCP colonies were selected and characterized in relation to the biochemical profile and the presence of the femA gene for identification of S. aureus. Thus, 246 isolates of S. aureus were identified and submitted to characterization of their resistance profiles in relation to 11 antimicrobials, by susceptibility tests and by the search of genes related to resistance. Taking into account the phenotypic results, 90.7% of S. aureus isolates showed resistance to sulfamethoxazole (SUL), 87.0% to ciprofloxacin (CIP), 67.9% to penicillin (PEN), 49.6% to erythromycin (IRI), 40.2% to oxacillin (OXA), 40.2% to clindamycin (CLI), 29.3% to rifampicin (RIF), 28.5% to chloramphenicol (CLO), 21.1% to tetracycline (TET), 16.3% vancomycin (VAN) and 6.5% gentamycin (GEN). Only 15 isolates were susceptible to all antimicrobials tested (isolates obtained from finishing bays, carcasses, shanks and sausage), 7 to only one antimicrobial (CIP, SUL or TET), and the other resistent simultaneously to 2 to 10 different antimicrobials; the resistance profile to PEN-ERI-CIP-SUL was the most frequent among S. aureus isolates (n = 37). Regarding the genes related to resistance to different antimicrobials, 74.0% of S. aureus isolates presented positive results for blaZ (PEN), 8.1% for femB (OXA), and 3.7% for tetK (TET); no positive results were observed for vanA (VAN), mecA and mecC (OXA). Among the S. aureus isolates, 60 did not present any of the studied genes, 164 had only one of the isolated genes (blaZ, femB and tetK), 15 simultaneously presented the femB- blaZ genes, 4 the blaZ-tetK genes, and 3 femB-blaZ-tetK genes. Only in relation to TET, the susceptibility test was equivalent to the presence of blaZ (p = 0.147), and no equivalence of results for OXA (femA, femB), VAN (vanA) and TET (tetK) (p < 0.05). The results obtained demonstrate the relevance of SCP as indicators of handling and hygiene in the pork production chain, as well as the presence of S. aureus with resistance to different antimicrobials, highlighting the need for monitoring by phenotypic and molecular methodologies.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-06-25T16:48:22Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1893649 bytes, checksum: 331fc7abfe38b077d8aacb8db5668851 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-25T16:48:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1893649 bytes, checksum: 331fc7abfe38b077d8aacb8db5668851 (MD5) Previous issue date: 2013-03-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os leites fermentados são ideais carreadores de micro-organismos probióticos devido a seu histórico de consumo e fabricação. A aplicação de bifidobactérias em produtos lácteos probióticos é geralmente associada a outras bactérias fermentadoras, com objetivos de garantir a qualidade tecnológica e sensorial do produto. A microbiota mista dos leites fermentados deve ser analisada diferencialmente com uso de meios seletivos para garantir a viabilidade e concentração de células. Metodologias alternativas rápidas para enumeração de micro-organismos, como o PetrifilmTM, são vantajosas para a indústria de alimentos, porém requerem prévia padronização. O objetivo desse trabalho foi adaptar meios seletivos para bifidobactérias com plaqueamento em PetrifilmTM AC. Cepas de bifidobactérias, lactobacilos e estreptococos foram pesquisadas em relação ao perfil de fermentação de carboidratos, redução e inibição por cloreto de 2,3,5- trifeniltetrazólio (TTC) e desenvolvimento em meios seletivos para bifidobactérias. Adicionalmente, o meio de cultura Rafinose-Propionato-MUP (RP-MUP) com plaqueamento convencional e em PetrifilmTM AC com diferentes tempos de incubação foi comparado com a metodologia da ISO29981 com meio TOS-MUP em leites fermentados produzidos. A rafinose foi o carboidrato que apresentou maior especificidade de fermentação por bifidobactérias, sendo considerada a fonte de carbono a ser utilizada no desenvolvimento do meio de cultura alternativo RP-MUP. Todas as cepas de Bifidobacterium spp. conseguiram reduzir adequadamente o TTC, e não foram inibidas nas concentrações 25, 50 e 100 mg/L. TOS-MUP e RP-MUP foram os meios de cultura que apresentaram melhor seletividade para bifidobactérias, quando comparadas aos meios MRS-ABC e MRS-NNLP. A associação do RP-MUP a placas PetrifilmTM AC permitiu a enumeração seletiva de bifidobactérias em leites fermentados, com equivalência de resultados com o RP-MUP e TOS-MUP utilizados pela metodologia convencional de plaqueamento (ANOVA, p < 0.05), e altos índices de correlação (r = 0.99, p < 0.05), inclusive em um tempo inferior de incubação (48 h). O protocolo alternativo proposto para enumeração de bifidobactérias em leites fermentados apresentou desempenho adequado, e representa uma vantagem para utilização pelas indústrias de alimentos no controle de qualidade de produtos probióticos com esses micro-organismos. / Fermented milks are ideal carriers of probiotic microorganisms due to their consumption and production history. The application of bifidobacteria in probiotic dairy products is usually associated with other fermenting bacteria, with the purpose of ensuring the technological and sensory qualities of the product. The mixed microbiota of fermented milks must be screened differentially with the usage of selective media to ensure the viability and concentration of the cells. Rapid alternative methodologies for the enumeration of microorganisms, like PetrifilmTM, are advantageous to the food industry, but they need previous standardization. The aim of this study was to adapt selective media for bifidobacteria with PetrifilmTM AC platting. Bifidobacteria, lactobacilli and streptococci strains were screened for carbohydrate fermentation profile, reduction and inhibition by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) and growth in selective media for bifidobacteria. Additionally, Raffinose-Propionate-MUP (RP-MUP) with conventional platting and using PetrifilmTM AC with different incubation times was compared to ISO29981 methodology with TOS-MUP medium in fermented milks produced. Raffinose was the carbohydrate that presented the higher fermentation specificity by bifidobacteria, being considered for the development of alternative selective medium RP-MUP. All bifidobacteria strains were able to adequately reduce TTC, and they were not inhibited by concentration of 25, 50 and 100 mg/L. TOS-MUP and RP-MUP were the culture media with best selectivity for bifidobacteria, when compared to MRS-ABC and MRS-NNLP media. RP-MUP and PetrifilmTM AC plates association allowed selective enumeration of bifidobacteria in fermented milks, with equivalent results for RP-MUP and TOS-MUP used with conventional platting methodology (ANOVA; p < 0.05), and high correlation indexes (r = 0.99; p < 0,05), even with shorter incubation time (48 h). The suggested alternative protocol for the enumeration of bifidobacteria in fermented milks presented adequate performance, and represents an advantage for the usage by food industries in the quality control of probiotic products with these microorganisms.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-09-06T14:03:31Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1674163 bytes, checksum: b5cc972ba56b4bcc4577fa26b6b1813f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-06T14:03:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1674163 bytes, checksum: b5cc972ba56b4bcc4577fa26b6b1813f (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / As doenças parasitárias representam um dos principais problemas para pecuária. No Brasil, a cisticercose é a patologia de maior ocorrência no exame postmortem de bovinos, gerando perdas econômicas para a cadeia produtiva da carne, além de constituir um problema para a saúde publica. Apesar disso, a mensuração das perdas econômicas devido a cisticercose bovina, assim como a origem de tais perdas ainda é negligenciada. Assim, estudos que integram informações do diagnóstico da cisticercose no frigorífico, somado à informação de origem do animal, possibilita a identificação das áreas de ocorrência da doença, quantificação e determinação de perdas econômicas. O objetivo da pesquisa foi o de avaliar as perdas econômicas relacionadas a dados epidemiológicos da cisticercose bovina rastreada a partir de estabelecimentos de abate e em propriedades rurais localizadas na Microrregião de Uberlândia de 2015 à 2017, analisados em diferentes cenários. Para tal foi realizado um estudo observacional analítico, do tipo transversal retrospectivo em abatedouro frigoríficos, simultaneamente a um levantamento sorológico da cisticercose bovina nas propriedades rurais, no período de janeiro de 2015 a agosto de 2017. Foram analisados os registros de condenação 1.186 animais positivos a cisticercose bovina num total de 175.947 abatidos (0,67% de prevalência) num abatedouro frigorífico localizado no município de Uberlândia e coletado amostras de sangue de 1024 bovinos e aplicado um questionário epidemiológico nas propriedades rurais. Foi realizado diagnóstico pelo método de inspeção postmortem (anatomopatológico) e pelo método laboratorial, utilizando o teste de ELISA (triagem), seguido do Immunoblot. As perdas econômicas no segmento da cadeia produtiva foram estimadas em 271.245 kg equivalente a R$ 570.667,95 sendo maior parte desta perda na obtenção da carne (R$565.093,75) em relação a produção animal (R$5.574,20). De acordo com a origem dos animais as maiores perdas ocorreram nas Microrregiões de Uberlândia e Araxá. Identificou­se a associação entre fatores de risco e as perdas econômicas como a ausência de assistência médico­veterinária, o acesso dos animais a rio/ribeirão, a não vermifugação dos animais e a origem dos animais. Este estudo revelou prevalência e perdas econômicas maiores no método de diagnóstico laboratorial, de 5,08% e R$12.185,33 em comparação ao método de diagnóstico anatomopatológico, com 0,62% de prevalência e perdas de R$1.496,51. Os resultados da pesquisa permitiram mensurar as perdas econômicas da cisticercose bovina na sua cadeia produtiva e determinar a origem de tais perdas. / Parasitic diseases represent one of the main problems for livestock farming. In Brazil, cysticercosis is the most frequent pathology in bovine postmortem examination, generating economic losses for the meat production chain, besides to constitute a problem for public health. Despite this, the measurement of economic losses due to bovine cysticercosis, as well as the origin of such losses is still neglected. Thus, studies that integrate information on the diagnosis of cysticercosis in the slaughterhouse, added to the information of origin of the animal, allows the identification of the areas of occurrence of the disease, quantification and determination of economic losses. The objective of the research was to evaluate the economic losses related to epidemiological data of bovine cysticercosis traced from slaughterhouses and rural properties located in the Microregion of Uberlândia from 2015 to 2017, analyzed in different scenarios. An observational, cross­sectional, retrospective cross­sectional study was carried out in a slaughterhouse at the same time as a serological survey of bovine cysticercosis in the rural properties, from January 2015 to August 2017. A total of 1,186 animals positive for bovine cysticercosis in a total of 175.947 slaughters (0,67% of prevalence) in a slaughterhouse located in the city of Uberlândia, and blood samples of 1024 cattle were collected and an epidemiological questionnaire was applied in the rural properties. The diagnosis was performed by the method of post­mortem inspection (pathology) and by the laboratory method, using ELISA (screening), followed by Immunoblot. The economic losses in the segment of the productive chain were estimated at 271.245 kg equivalent to R$ 570.667,95, most of this loss in obtaining the meat being (R$ 565,093.75) in relation to animal production (R$ 5.574,20). According to the origin of the animals, the greatest losses were to the Microregions of Uberlândia and Araxá. The association between risk fators and economic losses was identified as the absence of veterinary medical assistance, the access of the animals to the river / stream, the non­vermifugation of the animals and the origin of the animals. This study revealed a higher prevalence and economic losses due to a higher prevalence in the laboratory diagnosis method, 5.08% and R$ 12.185,33, compared to the method of pathological diagnosis at the post­mortem inspection, with a prevalence of 0.62% and a loss of R$ 1.496,51. The results of the research allowed to measure the economic losses of bovine cysticercosis in the productive chain and to determine the origin of such losses.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-09-21T15:03:52Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1299382 bytes, checksum: 25fc4d8303ddcd9bca8411b22d10cc7b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-21T15:03:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1299382 bytes, checksum: 25fc4d8303ddcd9bca8411b22d10cc7b (MD5) Previous issue date: 2018-07-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os produtos lácteos possuem uma microbiota autóctone bastante diversificada, na qual o grupo das Bactérias Ácido Lácticas (BAL) é de notável relevância devido às suas características benéficas, tecnológicas e bioconservantes, atraindo o interesse para sua utilização em diversos segmentos biotecnológicos, em especial na indústria de alimentos. O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar BAL bacteriocinogênicas de queijos artesanais, caracterizando aspectos ligados à produção e purificação das bacteriocinas, inocuidade, potencial benéfico dos isolados e propriedades inibitórias contra Listeria spp. As cepas bacteriocinogênicas Enterococcus hirae ST57ACC e Pediococcus pentosaceus ST65ACC foram isoladas a partir da técnica de tripla camada e identificadas por metodologias fenotípicas e moleculares. As bacteriocinas produzidas por E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC demostraram estabilidade em ampla faixa de pH e temperatura, e foram inativadas após tratamento com enzimas proteolíticas, comprovando sua natureza proteica. Tratamentos com EDTA, SDS, NaCl e Tween 80 não afetaram a atividade das bacteriocinas. Os sobrenadantes de ambos os isolados foram capazes de inibir Listeria innocua e diversas cepas de L. monocytogenes pertencentes à diferentes sorogrupos e obtidas de fontes distintas, inibindo completamente o desenvolvimento de L. monocytogenes após 12 h. Em co-culturas das cepas bacteriocinogênicas com a cepa indicadora L. monocytogenes 422 em leite desnatado, observou-se que E. hirae ST57ACC foi capaz de controlar a multiplicação do patógeno após 48 h. E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus não apresentaram resultados positivos para 25 genes relacionados a bacteriocinas conhecidas, indicando que podem produzir novas bacteriocinas. As cepas de E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram também avaliadas quanto ao seu potencial benéfico e segurança: ambos os isolados permaneceram viáveis após tratamento em condições gastrointestinais simuladas, exibindo altos níveis de auto e co-agregação com L. monocytogenes e níveis variados de hidrofobicidade, demonstrando que E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC podem prevenir potencialmente o estabelecimento de infecções pelo patógeno. Por meio da metodologia de agar-spot, avaliou-se a possibilidade de interferência de 33 medicamentos comerciais, de diferentes grupos sobre a multiplicação de E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC, revelando que apenas antiinflamatórios e medicamentos contendo loratadina e cloridrato de propranolol apresentaram atividade inibitória sobre as cepas. Testes fenotípicos para determinação da susceptibilidade antimicrobiana demonstraram que E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram resistentes à vancomicina, oxacilina e sulfa/trimetoprim dentre os 11 antibióticos testados pelo método de disco difusão. Com relação à PCR, poucos genes relacionados à resistência a antibióticos foi foram identificados. Nenhum dos isolados amplificou genes de produção de aminas biogênicas e nem apresentou produção das mesmas. A expressão de diferentes elementos do sistema de transporte ABC e metabolismo de açúcares foi identificada para ambos os isolados. Variações na proporção de inóculo não influenciaram a taxa de multiplicação de E. hirae ST57ACC nem de P. pentosaceus ST65ACC, no entanto, a produção de bacteriocinas foi detectada apenas 9 horas após a inoculação das cepas, quando inoculadas nas proporções de 5% e 10%. Adicionalmente, verificou-se que a densidade celular das cepas bacteriocinogênicas esteve correlacionada à produção de bacteriocinas em sistemas de fermentação tradicional e fermentação com controle de pH a 5,5 e agitação. E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram capazes de se multiplicar e produzir bacteriocinas na presença de xilo-oligossacarídeos após 6 horas de incubação, porém em níveis reduzidos quando comparados ao cultivo em meio MRS. Por fim, as bacteriocinas produzidas por E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram purificadas a partir de diferentes metodologias. A bacteriocina produzida por P. pentosaceus ST65ACC foi purificada em duas etapas, com rendimento final de 101,33 revelando- se um peptídeo com massa molecular de 3,5 a 8,5 kDa, determinado por SDS-PAGE. Em contrapartida, um protocolo de três etapas foi empregado na purificação da bacteriocina produzida por E. hirae ST57ACC, com rendimento final de 3,05. Adicionalmente, uma fração semi-purificada foi testada com a linhagem celular HT- 29, demonstrando que a bacteriocina não apresenta efeitos citotóxicos contra células humanas, sendo considerada segura neste aspecto. Os dados obtidos neste trabalho indicam que os isolados E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST57ACC podem ser considerados importantes ferramentas biotecnológicas na produção de bacteriocinas de interesse ao controle de L. monocytogenes e na biopreservação de alimentos. / Dairy products present a rich and diverse autochthonous microbiota, in which Lactic Acid Bacteria (LAB) are relevant, due to their beneficial, technological and biopreservative features, attracting the interest for their biotechnological application, in food industry, pharmaceutic area and human and veterinary medicine fields. The aim of this study was to isolate and to identify bacteriocinogenic LAB from artisanal cheeses, characterizing some aspects linked to bacteriocin production and purification, safety and beneficial potential of the isolates, as well as their inhibitory properties against Listeria spp. Bacteriocinogenic strains Enterococcus hirae ST57ACC and Pediococcus pentosaceus ST65ACC were isolated by using the triple- layer technique and identified by phenotypical and molecular methods. Bacteriocins produced by E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were stable in a wide range of pH and temperature, losing their activity after treatment with proteolytic enzymes, confirming their proteinaceous nature. Treatments with EDTA, SDS, NaCl and Tween 80 did not affect bacteriocin activity. Cell-free supernatants from both isolates were able to inhibit Listeria innocua and several L. monocytogenes strains, from different serogroups obtained from diverse sources, eliminating L. monocytogenes after 12 h. In co-culture experiments conducted in skimmed milk with the bacteriocinogenic isolates and the target strain L. monocytogenes 422, E. hirae ST57ACC controlled the target strain growth after 48 h. E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC did not present positive results for 25 known bacteriocin related genes, indicating that they might express new bacteriocins. E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC were also evaluated for their beneficial and safety features: both isolates remained viable after treatment replicating gastrointestinal conditions, showing high levels of auto and co-aggregation with L. monocytogenes and diverse levels of hydrophobicity, demonstrating that E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC might prevent the establishment of infections caused by this pathogen. Interference of 33 commercial drugs from different groups on growth of E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC was tested by agar-spot method, revealing that only anti-inflammatories and drugs containing loratadine and propranolol hydrochloride influenced the growth of bacteriocinogenic strains. Phenotypical tests employed to determine antibiotic susceptibility have shown that E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were resistant to vancomycin, oxacillin and sulfa/trimethoprim out of 11 antibiotics tested by disk-diffusion test, nonetheless low number of antibiotic resistance genes was observed by PCR analysis. None of the isolates amplified biogenic amines encoding genes neither presented phenotypical evidence of their production. Expression of different ABC transporters linked to bacteriocin export and sugar metabolism was detected, for both isolates. Changes in inoculum size did not influenced the growth of E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC; however, bacteriocin production was affected, and bacteriocins were detected only after 9 h with inoculation at 5% and 10% of bacteriocinogenic strains. Additionally, it was observed that cell density of both bacteriocinogenic strains was linked to bacteriocin production in traditional and pH at 5.5 and agitation controlled fermentation continuous. E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were capable to grow and produce bacteriocins in the presence of xylo-oligossacharides after 6 h of incubation, but in lower levels than those obtained with cultivation in MRS broth. Finally, E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were purified from different methods. The bacteriocin produced by P. pentosaceus ST65ACC was purified in two-steps, with final yield of 101.33, recognized as a 3.5 to 8.5 kDa peptide, determined by Tricine-SDS-PAGE. In contrast, a three-step-protocol was used to purify the bacteriocin produced by E. hirae ST57ACC, with final yield of 3.05. Moreover, a semi-purified fraction of E. hirae ST57ACC bacteriocin was tested in HT-29 cell-line, demonstrating no-cytotoxic effects in human cells, which means the bacteriocin can be considered safe in this aspect. Obtained data from this study indicate that E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST57ACC may be considered as important biotechnological tools for bacteriocin production to control L. monocytogenes and as biopreservatives in food.

Submitted by MARCOS LEANDRO TEIXEIRA DE OLIVEIRA (marcosteixeira@ufv.br) on 2018-11-12T16:59:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1349672 bytes, checksum: f372ec6057b9cd2f9a1df5d9bb5c6690 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-12T16:59:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1349672 bytes, checksum: f372ec6057b9cd2f9a1df5d9bb5c6690 (MD5) Previous issue date: 2018-08-16 / O objetivo do presente trabalho foi isolar e caracterizar bactérias ácido láticas (BAL) presentes em embutidos cárneos fermentados artesanais através de técnicas fenotípicas e genotípicas, buscando a seleção de isolados com potencial bacteriocinogênico. BAL isoladas foram obtidas de embutidos cárneos fermentados artesanais e foram caracterizadas quanto a sua atividade bacteriocinogênica; após o isolamento e identificação foram obtidos 5 diferentes isolados: Lactobacillus curvatus 12 e 36; Lactococcus garvieae 32 e Weissella viridescens 23 e 31 e realizada a detecção de genes de bacteriocinas; devido aos resultados encontrados em relação ao espectro de atividade e efeito de substâncias químicas e temperatura na atividade inibitória, três isolados foram selecionados (L. curvatus 12 e 36 e W. viridescens 23) para as demais análises para avaliar o potencial bacteriocinogênico. Os isolados selecionados apresentaram multiplicação distinta e a produção de bacteriocinas foi mais evidente em L. curvatus 12 e W. viridescens 23. As bacteriocinas produzidas foram adsorvidas pelas cepas produtoras em diferentes níveis. As bacteriocinas parcialmente purificadas mantiveram sua atividade inibitória após a eluição com 60% de isopropanol. Os padrões de lise celular foram semelhantes para todos os isolados testados. A detecção de β-galactosidase indicou desestabilização da permeabilidade da membrana celular das BAL isoladas. As bacteriocinas produzidas por L. curvatus 12 foram purificadas através do HPLC e foram identificados 4 diferentes sequências de peptídeos. Os isolados de BAL selecionados foram capazes de produzir bacteriocinas com alta atividade inibitória contra L. monocytogenes, indicando sua potencial aplicação na indústria de alimentos como bioconservadores. Para a avaliação da presença de genes de virulência, resistência a antibióticos e probióticos foram utilizados os cinco isolados anteriormente identificados. Todos os isolados testados foram positivos para mub, enquanto EF226-cbp, EF1249-fbp eEF2380-maz foram detectados em pelo menos um isolado; nenhum isolado apresentou os genes map, EFTu ou prgB. Os isolados testados apresentaram resultados variados em relação aos genes de virulência e nenhum isolado apresentou os genes gelE, cylA, efsA, cpd, int-Tn ou sprE. Os genes de resistência aos antibióticos também apresentaram resultados variados. Os isolados de BAL apresentaram alguns aspectos benéficos, além da produção de bacteriocinas, porém a presença de genes de virulência e resistência a antibióticos é um problema ao utilizar esses isolados como culturas starter ou bioconservadores em alimentos. Considerando o potencial inibitório dessas cepas, uma alternativa seria o uso de suas bacteriocinas após procedimentos de semi-purificação ou purificação. Linguiça frescal foi preparada e inoculada com diferentes combinações de L. curvatus 12 (BAL bacteriocinogênica), L. sakei ATCC 15521 (BAL não bacteriocinogênica), L. monocytogenes, nisina e a bacteriocina parcialmente purificada produzida por L. curvatus 12 e estocadas a 7 °C durante 10 dias. As análises microbiológicas foram realizadas nos dias 1, 4, 7 e 10 e as análises físico-químicas (controle) nos dias 1 e 10. No geral, as contagens de BAL não apresentaram diferenças significativas entre os tratamentos e ao longo do período de estocagem (p > 0.05). As contagens de L. monocytogenes em linguiça frescal inoculada com o patógeno e a BAL bacteriocinogênica variaram de 1.0 a 2.0 log UFC/g, sendo significativamente diferente da linguiça inoculada apenas com L. monocytogenes (p < 0.05). Nisina e a bacteriocina parcialmente purificadas também determinaram uma redução nas contagens de L. monocytogenes quando comparado com o tratamento que foi inoculado somente o patógeno, variando de 1.0 a 3.0 log UFC/g (p > 0.05). Esses resultados indicam que BAL bacteriocinogênica foi capaz de determinar uma redução significativa na contagem de L. monocytogenes em linguiça frescal estocada a 7 °C. / The aim of the study was isolate and characterized lactic acid bacteria (LAB) from artisanal fermented meat products through phenotypic and genotypic methodologies, searching for the selection of isolates with bacteriocinogenic potential. LAB isolates were obtained from artisanal fermented meat products and were characterized to their bacteriocinogenic activity; after isolation and identification were obtained 5 different isolates: Lactobacillus curvatus 12 and 36; Lactococcus garvieae 32 and Weissella viridescens 23 and 31 and the detection of bacteriocins related genes were performed; L. curvatus 12 and 36 e W. viridescens 23 were selected for the other analysis to evaluate the bacteriocinogenic potential. The selected isolates showed distinct growth and bacteriocin production was more evident in L. curvatus 12 and W. viridescens 23. The bacteriocins produced were adsorbed by the producing strains at different levels. Partially purified bacteriocins maintained their inhibitory activity after elution with 60% isopropanol. Cell lysis patterns were similar for all isolates tested. Detection of β-galactosidase indicated destabilization of the cell membrane permeability of the isolated BAL. The bacteriocins produced by L. curvatus 12 were purified by HPLC and four different peptide sequences were identified. The selected BAL isolates were able to produce bacteriocins with high inhibitory activity against L. monocytogenes, indicating their potential application in the food industry as bioconservatives. For the evaluation of the presence of virulence genes, resistance to antibiotics and probiotics, the five isolates previously identified were used. All isolates tested were positive for mub, while EF226-cbp, EF1249-fbp and EF2380-maz were detected in at least one isolate; none isolated showed map, EFTu or prgB. The isolates tested presented variable results in relation to the virulence genes and no isolates showed the genes gelE, cylA, efsA, cpd, int-Tn or sprE. Antibiotic resistance genes were also detected at different patterns. LAB isolates presented some beneficial aspects besides the production of bacteriocins, but the presence of virulence genes and resistance to antibiotics is a problem when using these isolates as starter or bioconservative cultures in foods. Considering the inhibitory potential of these strains, an alternative would be the use of their bacteriocins after semi-purification or purification procedures. Fresh sausage was prepared and inoculated with different combinations of L. curvatus 12 (bacteriocinogenic BAL), L. sakei ATCC 15521 (non bacteriocinogenic BAL), L. monocytogenes, nisin and partially purified bacteriocin produced by L. curvatus 12 and stored at 7 ° C for 10 days. Microbiological analyzes were performed on days 1, 4, 7 and 10 and physical-chemical analyzes (control) on days 1 and 10. In general, LAB counts did not show significant differences between treatments and throughout the storage period (p> 0.05). The counts of L. monocytogenes in fresh sausage inoculated with the pathogen and the bacteriocinogenic LAB varied from 1.0 to 2.0 log CFU/g, being significantly different from the sausage inoculated with only L. monocytogenes (p < 0.05). Nisin and partially purified bacteriocin also determined a reduction in the counts of L. monocytogenes when compared to the treatment that was inoculated only the pathogen, ranging from 1.0 to 3.0 log CFU/g (p> 0.05). These results indicate that the bacteriocinogenic LAB was able to determine a significant reduction in the count of L. monocytogenes in fresh sausage stored at 7 ° C.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-04T10:18:52Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 619624 bytes, checksum: 5386063ae0816c0b88770090de34a0a0 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-04T10:18:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 619624 bytes, checksum: 5386063ae0816c0b88770090de34a0a0 (MD5) Previous issue date: 2014-04-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Em condições de estresse ácido, micro-organismos do gênero Salmonella spp. utilizam como estratégia de sobrevivência um complexo mecanismo de tolerância que envolve vários genes. Os genes rpoS e nlpD são responsáveis pela expressão de proteínas que promovem a proteção da célula bacteriana contra os danos provocados pelo estresse, e os genes clpP, clpX e mviA estão envolvidos na regulação dessas proteínas no interior da célula. O presente estudo tem como objetivo associar as variações na expressão desses genes com as populações de Salmonella spp. durante um estresse ácido, condição que pode ser encontrada em carcaças bovinas que sofrem a aspersão de ácidos orgânicos para descontaminação microbiológica. A partir de uma coleção composta por 79 cepas de Salmonella spp., foi realizado um agrupamento genético por restrição enzimática através da técnica PFGE utilizando-se a enzima XbaI, e detecção dos genes rpoS, nlpD, clpP, clpX e mviA. Três cepas foram selecionadas (sorotipos: S. Derby, S. Typhimurium e S. Meleagridis) e semeadas em caldo extrato de carne com diferentes valores de pH (4,0, 5,0, e 6,0), ajustados com ácido lático e ácido acético. Logo após inoculação, e após 6, 12, 24 e 48 h de incubação a 37 °C, as populações bacterianas foram monitoradas por plaqueamento direto, e a expressão dos genes rpoS, nlpD, clpP, clpX e mviA por qPCR. Os resultados revelaram que Salmonella spp. pode se adaptar aos ácidos testados (acético e lático), principalmente quando estão em pH 5,0 ou 6,0, com expressão evidente do gene rpoS. Em pH 4,0, a redução completa das populações de Salmonella spp. ocorreu após 6 ou 24 h de incubação, o que em uma situação industrial representaria um período suficiente para que as proteínas da carne promovam o aumento do pH do meio, possibilitando dessa forma a adaptação de Salmonella spp. nesse substrato. A capacidade de adaptação de Salmonella spp. em valores de pH 5,0 e 6,0, demonstrada no presente estudo, ressalta a importância de um monitoramento adequado da redução de pH promovido pela aspersão de ácidos orgânicos em carcaças bovinas durante o processamento: caso o controle de pH não seja adequado, cepas de Salmonella spp. potencialmente contaminantes podem sobreviver e se manterem ativas nos produtos cárneos finais. Adicionalmente, é necessário que ocorra um equilíbrio entre a aplicação de ácidos orgânicos em concentrações que garantam o controle de Salmonella spp., além de outros micro-organismos, e a ausência de efeitos negativos sobre qualidade sensorial dos produtos cárneos, além de descoloração e exsudação. Os resultados obtidos permitem concluir que os ácidos orgânicos avaliados no presente estudo (ácido lático e ácido acético) podem ser considerados alternativas no controle de Salmonella spp., desde que ocorra um rígido controle dos valores de pH das soluções durante a interação com esse patógeno, e demanda o desenvolvimento de estudos em sistemas cárneos para demonstração desse comportamento. / Under acid stress conditions, Salmonella spp. presents a complex mechanism of tolerance that involves multiple genes. The rpoS, nlpD genes are responsible for the proteins expression that protect the bacterial cell against damage caused by acid stress, and clpP, clpX, mviA genes are involved in the regulation of these proteins inside the cell. The aim of this study was to associate the variations in these genes expression and Salmonella spp. populations when subjected to acid stress condition, a situation usually observed in bovine carcasses after cleaning procedures with organic acids spraying in slaughterhouse environment. Considering a culture collection composed by 79 Salmonella spp. strains, their fingerprinting were obtained by PFGE using XbaI, and all strains were subjected to PCR reactions to detect rpoS, nlpD, clpP, clpX, mviA genes. Based on the obtained data, three strains were selected (serotypes: S. Derby, S. Typhimurium and S. meleagridis) and inoculated in meat extract broth with different pH values (4.0, 5.0, and 6.0), adjusted with lactic acid and acetic acid. Immediately after inoculation, and after 6, 12, 24 and 48 h of incubation at 37 °C, the bacterial populations were monitored by direct plating, and the expression of rpoS, nlpD, clpP, clpX and mviA genes by qPCR . The results showed that Salmonella spp. can adapt to the tested acids (acetic and lactic), especially at pH 5.0 and 6.0, with evident expression of the rpoS gene. When the pH was adjusted to 4.0, complete reduction of Salmonella spp. populations occurred after 6 or 24 h of incubation, but in industrial situation this period would be sufficient for the meat proteins promote an increase in pH value, enabling the adaptation of Salmonella spp. on the substrate. The adaptability of Salmonella spp. at pH 5.0 and 6.0, as demonstrated in this study, shows the importance of adequate monitoring of pH reduction promoted by the organic acids spraying in bovine carcasses during processing: if pH control is not adequate, strains of Salmonella spp. can survive and remain active in the end meat products. Additionally, the ideal concentration of organic acids for the application in meat products depends in the balance between the pathogen contamination reduction and the absence of negative effects under sensorial quality. The results indicate that organic acids evaluated in the present study (lactic acid and acetic acid) can be considered as alternatives to control Salmonella spp., since associated to a rigorous pH control of the applied solutions during interaction with this pathogen. Furthermore, it demands further studies in meat systems to demonstrate this behavior.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-04T10:40:44Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 943889 bytes, checksum: 2c73252c1e6bb98d5e7d98fa75eb15c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-04T10:40:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 943889 bytes, checksum: 2c73252c1e6bb98d5e7d98fa75eb15c3 (MD5) Previous issue date: 2014-07-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As principais culturas starter utilizadas para produção de derivados cárneos fermentados são micro-organismos do grupo das bactérias láticas (BAL) e Staphylococcus coagulase negativa. Os gêneros Pediococcus e Lactobacillus possuem como principal característica a acidificação dos produtos e produção de compostos responsáveis pela determinação de aroma e sabor. Staphylococcus coagulase negativa contribuem para o desenvolvimento e a estabilidade da cor vermelha e para o desenvolvimento de outras propriedades sensoriais, como textura e aroma. O monitoramento adequado dessas populações é indispensável para manutenção da qualidade e inocuidade desses produtos. Porém, as metodologias convencionais de enumeração de culturas starter em alimentos possuem limitações quanto a praticidade e seletividade. Com isso, placas PetrifimTM AC tem sido empregadas para enumeração de culturas starter em produtos lácteos fermentados, desde que associadas a meios de cultura com agentes seletivos para grupos microbianos específicos. Considerando a escassez de dados científicos que demonstrem a pertinência de utilização de placas PetrifimTM AC associadas a meios de cultura seletivos para enumeração de BAL em produtos cárneos fermentados, o presente estudo tem como objetivo avaliar o uso de placas PetrfilmTMAC associado ao caldo MRS e vermelho de clorofenol para enumeração de culturas starter adicionadas em salames. Quatorze culturas puras e dois mix de culturas starter foram enumerados em seis protocolos diferentes: 1) PetrifilmTM AC associados ao caldo MRS adicionado de vermelho de clorofenol incubado em aerobiose e 2) em anaerobiose, 3) ágar MRS associado a vermelho de clorofenol, 4) MRS associado a púrpura de bromocresol, 5) MRS pH 5,7, e 6) ágar All Purpose Tween. Em seguida, amostras de salame foram obtidas e suas culturas starter enumeradas pelos protocolos 1, 2, 3 e 5. A análise de variância indicou ausência de diferenças significativas entre os protocolos de enumeração, independente dos tempos de incubação considerados (24, 48 e 72 horas). De maneira geral as contagens de culturas puras e culturas starter não apresentaram diferenças significativas considerando os diferentes tempos de incubação (exceto para AS 308 e S. xylosus em MRS com pH 5.7). Houve correlação significativa entre os protocolos, indicando a equivalência entre as contagens de culturas puras e culturas starter obtidas em aerobiose e em anaerobiose (p < 0,05). Os parâmetros de regressão linear também indicam correlações adequadas entre as contagens obtidas após 24, 48 e 72 h de incubação, indicando a confiabilidade dos resultados obtidos em um menor tempo de análise (24 h). Considerando os resultados obtidos na enumeração de culturas starter em salames, não foram observadas diferenças significativas entre os protocolos, independente dos tempos e condições de incubação e todas as correlações foram significativas (p < 0,05), indicando equivalências entre os protocolos independente das condições (aerobiose ou anaerobiose) e tempos (24, 48, 72h) de incubação. Após análise morfológica e identificação molecular de isolados obtidos das amostras de salame pelos protocolos avaliados, verificou-se uma seletividade adequada dos mesmos, que permitiram a formação de colônias apenas por micro-organismos dos gêneros Lactobacillus e Pediococcus, bem como Staphylococcus coagulase negativa, tipicamente utilizados como culturas starter para a produção de salame. Esses resultados confirmam a viabilidade da utilização de PetrifilmTM AC associado ao caldo MRS e vermelho de clorofenol para enumeração de culturas starter isoladas e em amostras de salame, em diferentes condições de aerobiose e em um reduzido período de incubação, representando vantagens a serem consideradas no monitoramento desses micro- organismos. / The main starter cultures used for the production of fermented meat products are microorganisms from the group of lactic acid bacteria (LAB) and Staphylococcus coagulase negative. Pediococcus and Lactobacillus present as main technological characteristic the acidification of products and production of compounds responsible for determining aroma and flavor. Staphylococcus coagulase negative contributes to the development and stability of the red color and the development of others sensory properties such as flavor and texture. Monitoring the populations is essential for maintaining the quality and safety of these products. However, conventional methods for enumeration of starter cultures in foods have limitations, due to poor selectivity and handling. Thus, PetrifilmTM AC plates have been used for enumeration of starter cultures in fermented dairy products, since associated with culture media with selective agents for specific microbial groups. Considering the lack of scientific data demonstrating the relevance of using PetrifilmTM AC plates associated with selective culture media for LAB enumeration in fermented meat products, the present study aimed to assess alternative protocols for the enumeration of starter culture in salami. Fourteen reference strains and two mix of starter cultures were plated on six different protocols: 1) PetrifilmTM AC added to MRS broth and chlorophenol red incubated in aerobiosis and 2) in anaerobiosis 3) agar MRS added to chlorophenol red 4) MRS added to bromocresol purple 5) MRS pH 5.7 and 6) agar All Purpose Tween. Then, samples of salami were obtained and their starter cultures enumerated by plating using protocols 1, 2, 3 and 5. The analysis of variance showed no significant differences between the enumeration protocols, independent of the incubation time: 24, 48 and 72 h. Generally, the counts of pure cultures of microorganisms and reference starter cultures showed no significant differences considering the different incubation times (except for AS 308 and S. xylosus in MRS at pH 5.7). The results indicated a significant correlation between the protocols, indicating equivalence between the counts of reference cultures and starter cultures in aerobiosis and anaerobiosis (p < 0.5). The linear regression parameters also indicate appropriate correlations between the counts obtained after 24, 48 and 72 h of incubation, indicating a reliability of the results obtained in a shorter analysis time (24 h). Considering the results obtained in the enumeration of starter cultures in salami, no significant differences were observed among the protocols considered, independent of time and incubation conditions, and all correlations were significant (p < 0.05), indicating equivalence between the protocols independent the conditions (aerobiosis and anaerobiosis) and time (24, 48 and 72 h) of incubation. After morphological and molecular identification of isolates obtained from samples of salami by the tested protocols, it was observed an adequate selectivity, which allowed the formation of colonies only by microorganisms of the genera Lactobacillus, Pediococcus and Staphylococcus coagulase negative, typically considered as starter cultures for the salami production. These results confirm the feasibility of using PetrifilmTM AC associated to MRS broth and chlorophenol red for enumeration of isolated starter cultures and starter cultures from salami samples, in different aerobic conditions and in a reduced incubation period, representing advantages to be considered during the monitoring of these microorganisms.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-11-16T15:33:56Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 838823 bytes, checksum: 982bfa8bcc9ffcfbc6012cbf3a3d91b3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-16T15:33:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 838823 bytes, checksum: 982bfa8bcc9ffcfbc6012cbf3a3d91b3 (MD5) Previous issue date: 2015-03-30 / A obtenção de alimentos com padrões de inocuidade e qualidade microbiológica é essencial, uma vez que alimentos contaminados estão frequentemente envolvidos em casos de enfermidades de origem alimentar. Nesse contexto, destaca-se a importância da pesquisa de micro-organismos indicadores de higiene e também de patógenos nas diferentes etapas da linha de abate e processamento. A pesquisa de Salmonella spp. é fundamental na cadeia produtiva de frangos, pelo fato desse patógeno ser frequentemente associado a esse alimento e à grande maioria das gastroenterites. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a qualidade microbiológica das carcaças e cortes de frango e do ambiente de abate em diferentes pontos das linhas de processamento de dois estabelecimentos industriais, através da pesquisa de micro- organismos indicadores de higiene e da pesquisa de Salmonella spp., bem como traçar as principais rotas de contaminação por esse patógeno através da identificação dos perfis genéticos dos isolados obtidos. Foram obtidas 277 amostras em dois matadouros de aves (Mt1-grande porte e Mt2-pequeno porte) localizados em Minas Gerais, Brasil, e consistiam de carcaças de frangos em três etapas distintas do abate (após depenagem- C1, após evisceração-C2, após pré-resfriamento-C3) e cortes finais (coxa, asa, peito) usando a metodologia de enxágue, e amostras de superfície (400cm2) de caixas de transportes de aves, esteiras de cortes, mãos de funcionários e facas. As amostras foram submetidas a análises laboratoriais para pesquisa de aeróbios mesófilos, enterobactérias, coliformes totais e Escherichia coli, e também à detecção de Salmonella spp. de acordo com a ISO 6975, e os isolados suspeitos foram confirmados por PCR pela identificação dos genes ompC e sifB. Ainda, todos os isolados confirmados como Salmonella spp. foram submetidos à macro-restrição por XbaI e eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Para as caixas de transporte, as contagens médias obtidas para todos os indicadores de higiene e a frequência de amostras positivas para Salmonella spp. não apresentaram diferenças significativas (p < 0,05) entre os matadouros estudados. Observou-se também que não houve diferença significativa (p < 0,05) de contaminação entre as carcaças coletadas nas etapas C1 e C2 para nenhum dos indicadores estudados, nem para Salmonella spp. No entanto, constatou-se que as médias de contaminação bem como a frequência de amostras positivas para Salmonella spp. encontradas nas duas primeiras etapas no Mt1 foram significativamente (p < 0,05) maiores do que aquelas encontradas no Mt2, e ainda houve uma redução significativa dos níveis de contaminação de todos os indicadores de higiene e do patógeno entre as etapas C1-C2 e C3 em ambos os matadouros (p < 0,05). As médias de contaminação para os cortes amostrados foram significantemente maiores em Mt2 do que em Mt1 (p < 0,05), o mesmo ocorrendo para as superfícies amostradas; entretanto, para essas amostras não foram encontradas diferenças significativas (p < 0,05) em relação a frequências de amostras positivas para Salmonella spp. Os resultados obtidos demonstraram a maior contaminação nas etapas iniciais de abate, bem como o maior controle na etapa de pré- resfriamento. Os resultados da macro-restrição para os isolados obtidos de caixas de transporte permitem observar diferentes perfis genéticos, indicando uma contínua inclusão de novas cepas de Salmonella spp. no matadouro proveniente das granjas de produção das aves. Nas etapas de abate, observou-se que isolados obtidos em diferentes etapas e/ou em diferentes lotes apresentaram perfis genéticos idênticos, evidenciando a persistência desses isolados entre os animais obtidos de diferentes granjas. Além disso, demonstrou-se que isolados obtidos na etapa de recepção (caixas de transporte) apresentaram perfis genéticos idênticos a isolados obtidos na etapa de abate e cortes finais. Assim, foi possível identificar as principais etapas da linha de abate e processamento de frangos envolvidas na contaminação por micro-organismos indicadores, e também traçar as possíveis rotas de contaminação por Salmonella spp., o que pode ser útil na determinação de medidas de controle por esses estabelecimentos. / Obtaining feedstuffs with high safety and high microbiological standards is essential since contaminated feedstuffs are commonly involved in cases of foodborne diseases. In this context, the importance of studies regarding hygiene indicator microorganisms is highlighted, as well as pathogens in different stages of the production chain. Research about Salmonella spp. is fundamental during slaughtering and processing of poultry due to the fact that these pathogens are often associated with feed and most cases of gastroenteritis. The aim of this study was to evaluate the microbiological quality of carcasses and cuts of chickens and the slaughtering environment at different points in the processing line at two industrial establishments through the study of hygiene indicator microorganisms and Salmonella spp., as well as to trace the main contamination routes by this pathogen through the identification of the gene profile from the isolates. 277 samples were obtained from two poultry slaughter houses (Mt1 - large size and Mt2 - small size) located in the Minas Gerais state, Brazil, and they consisted of poultry carcasses at three distinct slaughter steps (after de-feathering - C1, after evisceration - C2, after pre-cooling - C3) and final cuts (thigh, wing, breast) using the rinsing methodology; samples were also obtained from the surface (400 cm2) of the shipping boxes of chickens, cutting mats, hands of employees, and knives. The samples were subjected to laboratory analyses for the evaluation of mesophiles, enterobacteria, total coliforms, and Escherichia coli, as well as the detection of Salmonella spp. according to ISO 6975; the suspect isolates were confirmed by PCR through identification of genes ompC and sifB. Furthermore, all isolates that were confirmed as Salmonella spp. were subjected to macro-restriction by XbaI and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). For shipping boxes, the average counts that were obtained for all hygiene indicators and the frequency of positive samples for Salmonella spp. did not present with significant differences (P < 0.05) among the slaughterhouses that were studied. Also, there were no significant differences (P < 0.05) of contamination observed among carcasses that were collected in steps C1 and C2 for any indicator that was studied; the same result was observed for Salmonella spp. However, the average contamination as well as the frequency of positive samples for Salmonella spp. that was found in the two first steps for Sl1 were greater (P < 0.05) than those found for Sl2; also, there was a significant reduction in the contamination levels from all hygiene and pathogen indicators between steps C1-C2 and C3 for both slaughterhouses (P < 0.05). The average contamination for the sampled cuts was greater for Mt2 than Mt1 (P < 0.05), which was similarly observed for the sampled surfaces; although, for these samples, significant differences were not found (P < 0.05) in relation to the frequencies of positive samples for Salmonella spp. The results showed that there was greater contamination in the initial slaughter steps, such that greater control is necessary for the pre-cooling step. PFGE of the isolates that were obtained from the transport cages allowed us to observe different gene profiles, thereby indicating a continuous inclusion of new strains of Salmonella spp. in slaughterhouses from poultry production farms. In the slaughtering steps, the isolates that were obtained in different steps and/or different lots presented with identical PFGE profiles, which was evidence of the persistence of these isolates among animals obtained from different farms. Moreover, the isolates that were obtained in the reception step (shipping boxes) presented with identical PFGE profiles to those that were obtained in the slaughtering steps and end cuts. Therefore, it was possible to identify the main steps during slaughtering and processing of poultry that were involved in the contamination based on the indicator microorganisms and to trace the possible routes of contamination by Salmonella spp., which can be useful to determine control measures for these establishments.