Submitted by MARCOS LEANDRO TEIXEIRA DE OLIVEIRA (marcosteixeira@ufv.br) on 2018-11-12T16:59:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1349672 bytes, checksum: f372ec6057b9cd2f9a1df5d9bb5c6690 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-12T16:59:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1349672 bytes, checksum: f372ec6057b9cd2f9a1df5d9bb5c6690 (MD5) Previous issue date: 2018-08-16 / O objetivo do presente trabalho foi isolar e caracterizar bactérias ácido láticas (BAL) presentes em embutidos cárneos fermentados artesanais através de técnicas fenotípicas e genotípicas, buscando a seleção de isolados com potencial bacteriocinogênico. BAL isoladas foram obtidas de embutidos cárneos fermentados artesanais e foram caracterizadas quanto a sua atividade bacteriocinogênica; após o isolamento e identificação foram obtidos 5 diferentes isolados: Lactobacillus curvatus 12 e 36; Lactococcus garvieae 32 e Weissella viridescens 23 e 31 e realizada a detecção de genes de bacteriocinas; devido aos resultados encontrados em relação ao espectro de atividade e efeito de substâncias químicas e temperatura na atividade inibitória, três isolados foram selecionados (L. curvatus 12 e 36 e W. viridescens 23) para as demais análises para avaliar o potencial bacteriocinogênico. Os isolados selecionados apresentaram multiplicação distinta e a produção de bacteriocinas foi mais evidente em L. curvatus 12 e W. viridescens 23. As bacteriocinas produzidas foram adsorvidas pelas cepas produtoras em diferentes níveis. As bacteriocinas parcialmente purificadas mantiveram sua atividade inibitória após a eluição com 60% de isopropanol. Os padrões de lise celular foram semelhantes para todos os isolados testados. A detecção de β-galactosidase indicou desestabilização da permeabilidade da membrana celular das BAL isoladas. As bacteriocinas produzidas por L. curvatus 12 foram purificadas através do HPLC e foram identificados 4 diferentes sequências de peptídeos. Os isolados de BAL selecionados foram capazes de produzir bacteriocinas com alta atividade inibitória contra L. monocytogenes, indicando sua potencial aplicação na indústria de alimentos como bioconservadores. Para a avaliação da presença de genes de virulência, resistência a antibióticos e probióticos foram utilizados os cinco isolados anteriormente identificados. Todos os isolados testados foram positivos para mub, enquanto EF226-cbp, EF1249-fbp eEF2380-maz foram detectados em pelo menos um isolado; nenhum isolado apresentou os genes map, EFTu ou prgB. Os isolados testados apresentaram resultados variados em relação aos genes de virulência e nenhum isolado apresentou os genes gelE, cylA, efsA, cpd, int-Tn ou sprE. Os genes de resistência aos antibióticos também apresentaram resultados variados. Os isolados de BAL apresentaram alguns aspectos benéficos, além da produção de bacteriocinas, porém a presença de genes de virulência e resistência a antibióticos é um problema ao utilizar esses isolados como culturas starter ou bioconservadores em alimentos. Considerando o potencial inibitório dessas cepas, uma alternativa seria o uso de suas bacteriocinas após procedimentos de semi-purificação ou purificação. Linguiça frescal foi preparada e inoculada com diferentes combinações de L. curvatus 12 (BAL bacteriocinogênica), L. sakei ATCC 15521 (BAL não bacteriocinogênica), L. monocytogenes, nisina e a bacteriocina parcialmente purificada produzida por L. curvatus 12 e estocadas a 7 °C durante 10 dias. As análises microbiológicas foram realizadas nos dias 1, 4, 7 e 10 e as análises físico-químicas (controle) nos dias 1 e 10. No geral, as contagens de BAL não apresentaram diferenças significativas entre os tratamentos e ao longo do período de estocagem (p > 0.05). As contagens de L. monocytogenes em linguiça frescal inoculada com o patógeno e a BAL bacteriocinogênica variaram de 1.0 a 2.0 log UFC/g, sendo significativamente diferente da linguiça inoculada apenas com L. monocytogenes (p < 0.05). Nisina e a bacteriocina parcialmente purificadas também determinaram uma redução nas contagens de L. monocytogenes quando comparado com o tratamento que foi inoculado somente o patógeno, variando de 1.0 a 3.0 log UFC/g (p > 0.05). Esses resultados indicam que BAL bacteriocinogênica foi capaz de determinar uma redução significativa na contagem de L. monocytogenes em linguiça frescal estocada a 7 °C. / The aim of the study was isolate and characterized lactic acid bacteria (LAB) from artisanal fermented meat products through phenotypic and genotypic methodologies, searching for the selection of isolates with bacteriocinogenic potential. LAB isolates were obtained from artisanal fermented meat products and were characterized to their bacteriocinogenic activity; after isolation and identification were obtained 5 different isolates: Lactobacillus curvatus 12 and 36; Lactococcus garvieae 32 and Weissella viridescens 23 and 31 and the detection of bacteriocins related genes were performed; L. curvatus 12 and 36 e W. viridescens 23 were selected for the other analysis to evaluate the bacteriocinogenic potential. The selected isolates showed distinct growth and bacteriocin production was more evident in L. curvatus 12 and W. viridescens 23. The bacteriocins produced were adsorbed by the producing strains at different levels. Partially purified bacteriocins maintained their inhibitory activity after elution with 60% isopropanol. Cell lysis patterns were similar for all isolates tested. Detection of β-galactosidase indicated destabilization of the cell membrane permeability of the isolated BAL. The bacteriocins produced by L. curvatus 12 were purified by HPLC and four different peptide sequences were identified. The selected BAL isolates were able to produce bacteriocins with high inhibitory activity against L. monocytogenes, indicating their potential application in the food industry as bioconservatives. For the evaluation of the presence of virulence genes, resistance to antibiotics and probiotics, the five isolates previously identified were used. All isolates tested were positive for mub, while EF226-cbp, EF1249-fbp and EF2380-maz were detected in at least one isolate; none isolated showed map, EFTu or prgB. The isolates tested presented variable results in relation to the virulence genes and no isolates showed the genes gelE, cylA, efsA, cpd, int-Tn or sprE. Antibiotic resistance genes were also detected at different patterns. LAB isolates presented some beneficial aspects besides the production of bacteriocins, but the presence of virulence genes and resistance to antibiotics is a problem when using these isolates as starter or bioconservative cultures in foods. Considering the inhibitory potential of these strains, an alternative would be the use of their bacteriocins after semi-purification or purification procedures. Fresh sausage was prepared and inoculated with different combinations of L. curvatus 12 (bacteriocinogenic BAL), L. sakei ATCC 15521 (non bacteriocinogenic BAL), L. monocytogenes, nisin and partially purified bacteriocin produced by L. curvatus 12 and stored at 7 ° C for 10 days. Microbiological analyzes were performed on days 1, 4, 7 and 10 and physical-chemical analyzes (control) on days 1 and 10. In general, LAB counts did not show significant differences between treatments and throughout the storage period (p> 0.05). The counts of L. monocytogenes in fresh sausage inoculated with the pathogen and the bacteriocinogenic LAB varied from 1.0 to 2.0 log CFU/g, being significantly different from the sausage inoculated with only L. monocytogenes (p < 0.05). Nisin and partially purified bacteriocin also determined a reduction in the counts of L. monocytogenes when compared to the treatment that was inoculated only the pathogen, ranging from 1.0 to 3.0 log CFU/g (p> 0.05). These results indicate that the bacteriocinogenic LAB was able to determine a significant reduction in the count of L. monocytogenes in fresh sausage stored at 7 ° C.

Orientador: Mara Corrêa Lelles Nogueira / Banca: Dirce Yorika Kabuki / Banca: Mariza Landgraf / Banca: Fátima Pereira de Souza / Banca: Aripuanã Sakura Aranha Watanabe / Resumo: A resistência bacteriana aos antimicrobianos é um importante problema de saúde pública. Nos últimos anos tem sido frequente o isolamento de bactérias resistentes a partir de animais de produção e alimentos de origem animal. O objetivo desse estudo é identificar em Enterococcus spp. isolados de carnes (suína, bovina e frango) e de queijo Minas Frescal, o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos e a diversidade de genes de resistência aos antimicrobianos e de genes de virulência. Os resultados são comparados ao perfil observado em Enterococcus spp. isolados de pacientes internados em um hospital terciário no estado de São Paulo. Foram avaliados 102 Enterococcus spp. isolados de alimentos e 46 isolados clínicos. Entre os isolados de alimentos, 39% apresentaram resistência à tetraciclina, 32% à eritromicina, 17,5% à estreptomicina, 13% à norfloxacina, 10% ao cloranfenicol, 8% à ciprofloxacina e à fosfomicina, 6% à levofloxacina, 5,5% à quinupristina-dalfopristina, 4% à linezolida e à penicilina, 3,5% à moxifloxacina, 3% à ampicilina e 2% à gentamicina. Todos os Enterococcus spp. isolados de alimentos foram sensíveis à teicoplanina e à tigeciclina. Entre os isolados clínicos, 67,5% apresentaram resistência à ciprofloxacina, 56,5% à penicilina, 43,5% à ampicilina, 37% à estreptomicina, 24% à vancomicina e à teicoplanina, e 11% à gentamicina. Cepas multirrestentes foram detectadas entre os isolados de alimentos e de amostras clínicas. Nos Enterococcus isolados de alimentos resistentes à tetraciclina foram detectados os genes tet M, tet L, tet K e tet C. Os genes ant6-Ia e aac(6')-Ie/aph(2")-Ia foram detectados em cepas de alimentos e de origem clínica. Com relação aos genes de virulência, entre os Enterococcus isolados de alimentos, 48% apresentaram o gene efaA, 42% o gelE, 37,5% o ace, 15% o as, 13% o esp e 11% o... / Abstract: Bacterial resistance to antibiotics is a major public health. In recent years there has often been the isolation of resistant bacteria from production and animal food animals. The aim of this study is to identify in Enterococcus spp. isolated from meat (pork, beef and chicken) and Frescal Minas cheese, susceptibility profile to antimicrobials and the diversity of antimicrobial resistance genes and virulence genes. The results are compared to the profile observed in Enterococcus spp. isolated from patients admitted to a tertiary hospital in São Paulo. One hundread two Enterococcus spp. were isolated from food and 46 were from clinical isolates. Resistances to different classes of antimicrobials has been observed, and among the isolates of food were resistant to tetracycline (39%), erythromycin (32%), Streptomycin (17.5%), norfloxacin (13%), chloramphenicol (10%), ciprofloxacin and fosfomycin (8%), levofloxacin (6%), quinupristin-dalfopristin (5.5%), penicillin and linezolid (4%), moxifloxacin (3.5%), ampicillin (3%) and gentamicin (2%). All Enterococcus spp. isolates from foods were sensitive to teicoplanin and tigecycline. Among clinical isolates, were resistant to ciprofloxacin (67.5%), penicillin (56.5%), ampicillin (43.5%), streptomycin (37%), vancomycin and teicoplanin (24%) and gentamicin (11%). Multidrug-resistant strains were detected among isolates from food and clinical samples. In Enterococcus spp. tetracycline resistant, the genes tet M, tet L, tet K and tet C were detected. The genes ant6-la and aac(6')-Ie/aph(2")-Ia were detected in strains of food and clinical origin. Regarding the virulence genes among Enterococcus isolates from food, 48% had the gene efaA, 42% the gelE, 37.5% the ace, 15% the as, 13% the esp and 11% the cyl. Among the clinical isolates, 61% had the ace, 56.5% the efaA, 43.5% the gelE, 11% the cyl and esp, and 6,5% the as. The hyl gene was ... / Doutor