Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-11-18T09:04:50Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 658681 bytes, checksum: 11991dd14f8b7cdea12ab42eb1a397f1 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-18T09:04:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 658681 bytes, checksum: 11991dd14f8b7cdea12ab42eb1a397f1 (MD5) Previous issue date: 2015-07-21 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Listeria monocytogenes pode contaminar produtos cárneos principalmente através de contaminação cruzada de utensílios expostos a produtos crus. A qualidade destes produtos pode ser ainda estimada através da pesquisa de micro-organismos indicadores de higiene, o que não isenta a pesquisa de patógenos para garantia de inocuidade. A contaminação por L. monocytogenes em ambientes de processamento de alimentos é de difícil controle, devido a sua ampla disseminação e adaptação, o que demanda monitoramento constante e adoção de procedimentos eficientes para eliminação desse patógeno. A primeira etapa deste trabalho identificou as principais fontes de contaminação microbiológica no ambiente de processamento de três açougues, quando amostras superfíciais foram obtidas de mesas, facas, interior do balcão refrigeração, moedores e amaciadores de carne (20 amostras por área) e submetidas à enumeração de micro-organismos indicadores de higiene, e pesquisa de L. monocytogenes, cujos isolados obtidos foram caracterizados quanto aos seus sorogrupos e genes de virulência. Os resultados demostraram que não houve diferenças nos níveis de contaminação por micro-organismos indicadores de higiene entre os três estabelecimentos analisados; as amostras com contagens acima de valores referenciais indicaram ineficiêncianos procedimentos de higienização praticados. 87 amostras apresentaram resultado positivo para Listeria spp. (60,4 %), sendo 22 amostras de mesa, 20 de moedor, 16 de faca, 13 de mão, 9 de amaciador e 7 do balcão de refrigeração. Um total de 31 amostras (21,5 %) foram positivas para L. monocytogenes, indicando a presença do patógeno no ambiente de processamento de produtos cárneos. Na caracterização dos sorotipos, 52 isolados foram caracterizados como pertencentes aos sorogrupos 1/2c ou 3c, e 22 isolados como pertencentes aos sorogrupos 4b, 4d, 4a ou 4c. Na pesquisa dos genes de virulência, todos os 74 isolados apresentaram resultados positivos para os genes hlyA, iap,plcA, actA e para o grupo das internalinas (inlA, inlB, inlC e inlJ). Na segunda etapa do estudo,foi avaliado a ocorrência de L. monocytogenes (ISO 11.290 1/2) em utensílios e ambiente de manipulação em um açougue, e os isolados obtidos foram caracterizados quanto aos seus sorogrupos e genes de virulência e ainda avaliados quanto à capacidade de adesão in vitro e sensibilidade a dois sanitizantes (Mister Max-DG1 ® e B-QUART SEPT ®). Do total de 40 amostras de mesas, facas, interior do balcão refrigeração, moedores e amaciadores de carne, 75 % foram positivas para Listeria spp. e 22,5 % para L. monocytogenes. Todos os isolados obtidos foram caracterizados como sorogrupos 1/2c ou 3c, e apresentaram resultados positivos para todos os genes de virulência analisados. Adicionalmente, todos os isolados apresentaram algum potencial de adesão, em sua maioria apresentando potenciais de adesão variando de fraco a moderado, sendo que somente um isolado apresentou um forte potencial de adesão. Os sanitizantes avaliados apresentaram potencial para inibir da multiplicação dos isolados em diferentes concentrações (1:256 a 1:512 para Mister Max-DG1 ®, e 1:4.096 a 1:16.384 para B- QUART SEPT ®), e interferiram na formação e remoção de biofilmes pelos isolados. Após avaliação, os sanitizantes foram adotados na rotina de higienização do estabelecimento comercial, e após 2 meses, amostras superficiais dos mesmos utensílios e equipamentos foram coletadas e submetidas a análise de L. monocytogenes, e nenhum resultado positivo foi identificado. Os resultados obtidos permitiram caracterizar os sorugrupos dos isolados de L. monocytogenes obtidos bem como a o seu potencial virulento, foi também demostrado o potencial de adesão de L. monocytogenes e a eficiência dos sanitizantes Mister Max-DG1 ® e B-QUART SEPT ® para o controle da contaminação por esse patógeno. Os resultados indicam que o estabelecimento de procedimentos adequados para redução das contagens microbianas e controle da disseminação de L. monocytogenes nas etapas finais da cadeia produtiva da carne é de extrema importância, com reflexos evidentes na qualidade e inocuidade dos produtos cárneos destinados ao consumo humano. Adicionalmente, verificou-se o potencial de adesão de L. monocytogenes e a eficiência dos sanitizantes Mister Max-DG1 ® e B- QUART SEPT ® para o controle da contaminação superficial por esse patógeno. / Listeria monocytogenes can contaminate meat products primarily through cross- contamination of utensils exposed to raw products. The quality of these products can still be estimated through the research of hygiene indicator microorganisms, which does not exclude the research of pathogens to assure the food safety. Contamination by L. monocytogenes in food processing environments is difficult to control due to its wide dissemination and adaptation, which requires constant monitoring and adoption of efficient procedures to eliminate this pathogen. In the first step of this study, we identified the main sources of microbiological contamination in three butchers processing environment by collecting surface samples from the hands of employees, tables, knives, inner of butcher display, grinders and meat tenderizers (24 samples per area). Samples were subjected toenumeration of hygiene indicator microorganisms and detection of L. monocytogenes, being the isolates characterized for their virulence genes and serogroups. The results demonstrated absence of differences in the levels of contamination by hygiene indicators microorganisms analyzed between the three butcher shops; samples with counts higher than reference values indicated inefficiency in practiced hygiene procedures. 87 samples were positive for Listeria spp. (60.4 %), being 22 samples from table, 20 from grinders, 16 from knives, 13 from hands, 9 from meat tenderizers and 7 from the inner of butcher display. 31 samples (21.5 %) were positive for L. monocytogenes, indicating the presence of the pathogen in meat processing environment. 52 isolates were characterized as belonging to serogroup 1/2c or 3c, and 22 isolates belonged to serogroups 4b, 4d, 4a or 4c. All 74 isolates showed positive results for hlyA genes, iap, plcA, actA and the group of internalins (InlA, inlB, inLC and inlJ). In the second step of the study, we evaluated the occurrence of L. monocytogenes in the processing environment of a butcher shop, and the obtained isolates were isolates were characterized as to their serogroups and virulence genes and further evaluated for in vitro adhesion capacity sensitivity to two sanitizers (Mister Max-DG1 ® and B-QUART SEPT ®). Of the total of 40 samples hands of manipulators, tables, knives, inner of butcher display, grinders and meat tenderizers, 75 % were positive for Listeria spp. and 22,5 % for L. monocytogenes. All isolates were characterized as belonging to serogroup 1/2c or 3c, and showed positive results for all virulence genes analyzed. In addition, all isolates showed some potential of adhesion, mostly presenting potential of adhesion ranging from weak to moderate, and only one isolate showed a strong potential. The evaluated sanitizers had potential to inhibit the multiplication of isolates in different concentrations (1: 256-1: 512 for Mister Max-DG1 ® , and 1: 4096-1: 16,384 for B-QUART SEPT ®) , and interfered in the formation and removal of the biofilms. After evaluation, the sanitizers were adoptedby the butcher shop cleaning routine, and after two months surface samples from the same utensils and equipment were collected and subjected to L. monocytogenes analysis, and no positive result was identified. The results allowed to characterize the sorugrupos of L. monocytogenes isolates obtained as well as their virulent potential, it has also demonstrated the potential of adhesion of L. monocytogenes and the effectiveness of sanitizers Mister Max-DG1 ® and B-QUART SEPT ® to control contamination by this pathogen. Results indicate that the establishment of appropriate procedures to reduce microbial counts and controlling the spread of L. monocytogenes in the final stages of meat production chain is of utmost importance, with obvious effects on the quality and safety of meat products for human consumption. Additionally, it was found L. monocytogenes adhesion potential and the efficiency of the sanitizing Mister Max- DG1 ® and B -quart SEPT ® for the control of surface contamination by these pathogens.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-09-24T11:56:18Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1299382 bytes, checksum: 25fc4d8303ddcd9bca8411b22d10cc7b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-24T11:56:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1299382 bytes, checksum: 25fc4d8303ddcd9bca8411b22d10cc7b (MD5) Previous issue date: 2018-07-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os produtos lácteos possuem uma microbiota autóctone bastante diversificada, na qual o grupo das Bactérias Ácido Lácticas (BAL) é de notável relevância devido às suas características benéficas, tecnológicas e bioconservantes, atraindo o interesse para sua utilização em diversos segmentos biotecnológicos, em especial na indústria de alimentos. O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar BAL bacteriocinogênicas de queijos artesanais, caracterizando aspectos ligados à produção e purificação das bacteriocinas, inocuidade, potencial benéfico dos isolados e propriedades inibitórias contra Listeria spp. As cepas bacteriocinogênicas Enterococcus hirae ST57ACC e Pediococcus pentosaceus ST65ACC foram isoladas a partir da técnica de tripla camada e identificadas por metodologias fenotípicas e moleculares. As bacteriocinas produzidas por E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC demostraram estabilidade em ampla faixa de pH e temperatura, e foram inativadas após tratamento com enzimas proteolíticas, comprovando sua natureza proteica. Tratamentos com EDTA, SDS, NaCl e Tween 80 não afetaram a atividade das bacteriocinas. Os sobrenadantes de ambos os isolados foram capazes de inibir Listeria innocua e diversas cepas de L. monocytogenes pertencentes à diferentes sorogrupos e obtidas de fontes distintas, inibindo completamente o desenvolvimento de L. monocytogenes após 12 h. Em co-culturas das cepas bacteriocinogênicas com a cepa indicadora L. monocytogenes 422 em leite desnatado, observou-se que E. hirae ST57ACC foi capaz de controlar a multiplicação do patógeno após 48 h. E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus não apresentaram resultados positivos para 25 genes relacionados a bacteriocinas conhecidas, indicando que podem produzir novas bacteriocinas. As cepas de E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram também avaliadas quanto ao seu potencial benéfico e segurança: ambos os isolados permaneceram viáveis após tratamento em condições gastrointestinais simuladas, exibindo altos níveis de auto e co-agregação com L. monocytogenes e níveis variados de hidrofobicidade, demonstrando que E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC podem prevenir potencialmente o estabelecimento de infecções pelo patógeno. Por meio da metodologia de agar-spot, avaliou-se a possibilidade de interferência de 33 medicamentos comerciais, de diferentes grupos sobre a multiplicação de E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC, revelando que apenas antiinflamatórios e medicamentos contendo loratadina e cloridrato de propranolol apresentaram atividade inibitória sobre as cepas. Testes fenotípicos para determinação da susceptibilidade antimicrobiana demonstraram que E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram resistentes à vancomicina, oxacilina e sulfa/trimetoprim dentre os 11 antibióticos testados pelo método de disco difusão. Com relação à PCR, poucos genes relacionados à resistência a antibióticos foi foram identificados. Nenhum dos isolados amplificou genes de produção de aminas biogênicas e nem apresentou produção das mesmas. A expressão de diferentes elementos do sistema de transporte ABC e metabolismo de açúcares foi identificada para ambos os isolados. Variações na proporção de inóculo não influenciaram a taxa de multiplicação de E. hirae ST57ACC nem de P. pentosaceus ST65ACC, no entanto, a produção de bacteriocinas foi detectada apenas 9 horas após a inoculação das cepas, quando inoculadas nas proporções de 5% e 10%. Adicionalmente, verificou-se que a densidade celular das cepas bacteriocinogênicas esteve correlacionada à produção de bacteriocinas em sistemas de fermentação tradicional e fermentação com controle de pH a 5,5 e agitação. E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram capazes de se multiplicar e produzir bacteriocinas na presença de xilo-oligossacarídeos após 6 horas de incubação, porém em níveis reduzidos quando comparados ao cultivo em meio MRS. Por fim, as bacteriocinas produzidas por E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram purificadas a partir de diferentes metodologias. A bacteriocina produzida por P. pentosaceus ST65ACC foi purificada em duas etapas, com rendimento final de 101,33 revelando- se um peptídeo com massa molecular de 3,5 a 8,5 kDa, determinado por SDS-PAGE. Em contrapartida, um protocolo de três etapas foi empregado na purificação da bacteriocina produzida por E. hirae ST57ACC, com rendimento final de 3,05. Adicionalmente, uma fração semi-purificada foi testada com a linhagem celular HT- 29, demonstrando que a bacteriocina não apresenta efeitos citotóxicos contra células humanas, sendo considerada segura neste aspecto. Os dados obtidos neste trabalho indicam que os isolados E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST57ACC podem ser considerados importantes ferramentas biotecnológicas na produção de bacteriocinas de interesse ao controle de L. monocytogenes e na biopreservação de alimentos. / Dairy products present a rich and diverse autochthonous microbiota, in which Lactic Acid Bacteria (LAB) are relevant, due to their beneficial, technological and biopreservative features, attracting the interest for their biotechnological application, in food industry, pharmaceutic area and human and veterinary medicine fields. The aim of this study was to isolate and to identify bacteriocinogenic LAB from artisanal cheeses, characterizing some aspects linked to bacteriocin production and purification, safety and beneficial potential of the isolates, as well as their inhibitory properties against Listeria spp. Bacteriocinogenic strains Enterococcus hirae ST57ACC and Pediococcus pentosaceus ST65ACC were isolated by using the triple- layer technique and identified by phenotypical and molecular methods. Bacteriocins produced by E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were stable in a wide range of pH and temperature, losing their activity after treatment with proteolytic enzymes, confirming their proteinaceous nature. Treatments with EDTA, SDS, NaCl and Tween 80 did not affect bacteriocin activity. Cell-free supernatants from both isolates were able to inhibit Listeria innocua and several L. monocytogenes strains, from different serogroups obtained from diverse sources, eliminating L. monocytogenes after 12 h. In co-culture experiments conducted in skimmed milk with the bacteriocinogenic isolates and the target strain L. monocytogenes 422, E. hirae ST57ACC controlled the target strain growth after 48 h. E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC did not present positive results for 25 known bacteriocin related genes, indicating that they might express new bacteriocins. E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC were also evaluated for their beneficial and safety features: both isolates remained viable after treatment replicating gastrointestinal conditions, showing high levels of auto and co-aggregation with L. monocytogenes and diverse levels of hydrophobicity, demonstrating that E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC might prevent the establishment of infections caused by this pathogen. Interference of 33 commercial drugs from different groups on growth of E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC was tested by agar-spot method, revealing that only anti-inflammatories and drugs containing loratadine and propranolol hydrochloride influenced the growth of bacteriocinogenic strains. Phenotypical tests employed to determine antibiotic susceptibility have shown that E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were resistant to vancomycin, oxacillin and sulfa/trimethoprim out of 11 antibiotics tested by disk-diffusion test, nonetheless low number of antibiotic resistance genes was observed by PCR analysis. None of the isolates amplified biogenic amines encoding genes neither presented phenotypical evidence of their production. Expression of different ABC transporters linked to bacteriocin export and sugar metabolism was detected, for both isolates. Changes in inoculum size did not influenced the growth of E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC; however, bacteriocin production was affected, and bacteriocins were detected only after 9 h with inoculation at 5% and 10% of bacteriocinogenic strains. Additionally, it was observed that cell density of both bacteriocinogenic strains was linked to bacteriocin production in traditional and pH at 5.5 and agitation controlled fermentation continuous. E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were capable to grow and produce bacteriocins in the presence of xylo-oligossacharides after 6 h of incubation, but in lower levels than those obtained with cultivation in MRS broth. Finally, E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were purified from different methods. The bacteriocin produced by P. pentosaceus ST65ACC was purified in two-steps, with final yield of 101.33, recognized as a 3.5 to 8.5 kDa peptide, determined by Tricine-SDS-PAGE. In contrast, a three-step-protocol was used to purify the bacteriocin produced by E. hirae ST57ACC, with final yield of 3.05. Moreover, a semi-purified fraction of E. hirae ST57ACC bacteriocin was tested in HT-29 cell-line, demonstrating no-cytotoxic effects in human cells, which means the bacteriocin can be considered safe in this aspect. Obtained data from this study indicate that E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST57ACC may be considered as important biotechnological tools for bacteriocin production to control L. monocytogenes and as biopreservatives in food.

O presente estudo teve por objetivos padronizar a reação em cadeia pela polimerase (PCR) para a identificação da espécie bovina, suína e canina em amostras de carne utilizando diferentes concentrações (0% 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%); analisar as amostras provenientes de vistorias realizadas pela Coordenação de Vigilância à Saúde (COVISA) do Município de São Paulo e, aferir os custos do método para oferecer como atividade de extensão, as análises laboratoriais. Na padronização o limite mínimo de detecção foi de 0,1% para material bovino, 0,01% para suíno e 10% para cão. É necessário aprimorar a técnica na identificação de cães e testar outros primers, além de padronizar outras espécies. Cinquenta e três amostras foram encaminhadas pela COVISA, sendo analisadas e obtendo os seguintes resultados: 60% bovina, 19% suína, 13% espécie não foi identificada (falta do primer específico) e em 8% ocorreu algum tipo de contaminação da amostra, provavelmente no estabelecimento vistoriado (contaminação cruzada). O custo final da reação para três espécies foi de R$ 100,47 sendo R$ 55,27 (55,01%) correspondente aos reagentes e R$ 45,20 (44,99%) referente a mão de obra. O tempo médio para obtenção dos resultados foi de 9h0323, estimado sem qualquer contaminação ou repetição de etapa / The present study aimed at standardizing the reaction polymerase chain (PCR) for the identification of bovine, porcine and canine meat samples using different concentrations (0% 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%); at analyzing samples originated from inspections made by the Health Surveillance Coordination (COVISA) of São Paulo, and at evaluating method costs in order to offer laboratorial analyses as an extension activity. In the standardization, the minimum detection limit was of 0.1% for bovine, 0.01% for porcine and 10% for canine material. It is necessary to improve the identification technique in dogs and to test other primers, in addition to standardizing other species. Fifty-three samples were sent by COVISA, and after analysis the following results were obtained: 60% were from bovines, 19% from porcines and 13% from non-identified species (lack of specific primer) in addition to some sort of contamination, probably from the inspected establishment, occurred in 8% of the samples (cross contamination). The final cost of the reaction for the three species was R$ 100.47, out of which R$ 55.27 (55.01%) corresponded to reagents and R$ 45.20 (44.99%) to work labor. The average time for obtaining results was 9h0323, estimated without the occurrence of any contamination or repetition of the step

O presente estudo teve por objetivos padronizar a reação em cadeia pela polimerase (PCR) para a identificação da espécie bovina, suína e canina em amostras de carne utilizando diferentes concentrações (0% 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%); analisar as amostras provenientes de vistorias realizadas pela Coordenação de Vigilância à Saúde (COVISA) do Município de São Paulo e, aferir os custos do método para oferecer como atividade de extensão, as análises laboratoriais. Na padronização o limite mínimo de detecção foi de 0,1% para material bovino, 0,01% para suíno e 10% para cão. É necessário aprimorar a técnica na identificação de cães e testar outros primers, além de padronizar outras espécies. Cinquenta e três amostras foram encaminhadas pela COVISA, sendo analisadas e obtendo os seguintes resultados: 60% bovina, 19% suína, 13% espécie não foi identificada (falta do primer específico) e em 8% ocorreu algum tipo de contaminação da amostra, provavelmente no estabelecimento vistoriado (contaminação cruzada). O custo final da reação para três espécies foi de R$ 100,47 sendo R$ 55,27 (55,01%) correspondente aos reagentes e R$ 45,20 (44,99%) referente a mão de obra. O tempo médio para obtenção dos resultados foi de 9h0323, estimado sem qualquer contaminação ou repetição de etapa / The present study aimed at standardizing the reaction polymerase chain (PCR) for the identification of bovine, porcine and canine meat samples using different concentrations (0% 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%); at analyzing samples originated from inspections made by the Health Surveillance Coordination (COVISA) of São Paulo, and at evaluating method costs in order to offer laboratorial analyses as an extension activity. In the standardization, the minimum detection limit was of 0.1% for bovine, 0.01% for porcine and 10% for canine material. It is necessary to improve the identification technique in dogs and to test other primers, in addition to standardizing other species. Fifty-three samples were sent by COVISA, and after analysis the following results were obtained: 60% were from bovines, 19% from porcines and 13% from non-identified species (lack of specific primer) in addition to some sort of contamination, probably from the inspected establishment, occurred in 8% of the samples (cross contamination). The final cost of the reaction for the three species was R$ 100.47, out of which R$ 55.27 (55.01%) corresponded to reagents and R$ 45.20 (44.99%) to work labor. The average time for obtaining results was 9h0323, estimated without the occurrence of any contamination or repetition of the step