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Previous issue date: 2016-01-13 / Os eosinófilos são leucócitos que estão envolvidos em respostas inflamatórias, alérgicas e imunoreguladoras, através da secreção de proteínas catiônicas e citocinas armazenadas em seus grânulos específicos. Os mecanismos de secreção podem ocorrer por: (i) desgranulação por piecemeal (PMD), caraterizada pelo transporte mediado por vesículas que brotam dos grânulos e levam os produtos até a superfície celular; (ii) exocitose clássica, caracterizada pela fusão dos grânulos com a membrana plasmática e (iii) citólise, quando os grânulos são liberados após lise celular. O CD63 é uma molécula da família das tetraspaninas que parece atuar como facilitador na secreção de mediadores da inflamação. Entretanto, não existem estudos ultraestruturais que demonstrem a associação de CD63 com processos de secreção de eosinófilos. Este trabalho teve por objetivo investigar a mobilização de CD63 e sua correlação com mecanismos de secreção em eosinófilos humanos estimulados com mediadores inflamatórios (eotaxina e fator de necrose tumoral -TNF-\03B1). A expressão de CD63 foi investigada na superfície celular através de imunofluorescência e em compartimentos subcelulares através de imunomarcação pre-embedding por microscopia eletrônica de transmissão que permite melhor preservação antigênica e os anticorpos mostram ótimo acesso a microdomínios celulares com partículas de ouro (1.4 nm) conjugadas a anticorpos secundários
A imunofluorescência mostrou elevada expressão de CD63 na superfície celular, mas com padrões diferentes dependendo do estímulo. Enquanto a eotaxina induziu imunomarcação pontual, a expressão de CD63, induzida por TNF- \03B1, mostrou-se de maneira difusa, indicando a ocorrência de processos de secreção diferentes. As análises ultraestruturais revelaram que a eotaxina induziu PMD, enquanto o TNF-\03B1 desencadeou exocitose clássica. O CD63 foi detectado principalmente nos grânulos de secreção. As análises quantitativas mostraram que nos grupos estimulados ocorreu aumento significativo do número de grânulos CD63- positivos em comparação com o grupo controle não estimulado. Além disso, 89,94 % dos grânulos sofrendo PMD (grupo eotaxina) e 84,73% dos grânulos sofrendo fusão (grupo TNF-\03B1) eram positivos para CD63. A marcação para CD63 foi também documentada em endossomos e em vesículas, incluindo vesículas tubulares típicas de eosinófilos (Eosinophil Sombrero Vesicles \2013 EoSVs), envolvidas no transporte de moléculas dos grânulos. Em conjunto, nossos dados demonstraram, pela primeira vez, que CD63 é um marcador tanto de grânulos de secreção como de processos secretores envolvidos na liberação de produtos de eosinófilos. Isto é importante para o entendimento de mecanismos de liberação de mediadores imunes durante respostas de eosinófilos a doenças alérgicas e inflamatórias / Eosinophils are leukocytes involved with inflammatory, allergic and
immmunoregulatory responses through the secretion of granule-stored cationic
proteins and cytokines. Secretion can occur by: (i) piecemeal degranulation (PMD),
characterized by vesicle-mediated transport of products from granules to cell surface;
(ii) classical exocytosis, characterized by granule fusion with the plasma membrane e
(iii) cytolysis, in which the granule content is released after cell lysis. CD63 is a
tetraspanin family molecule which seems to act as a facilitator during secretion of
inflammatory mediators. However, there are no ultrastructural studies demonstrating
association of CD63 with secretory processes of eosinophils. The goal of this work
was to investigate the mobilization of CD63 and its association with mechanisms of
secretion in human eosinophils stimulated with inflammatory mediators (eotaxin and
tumoral necrosis factor-TNF-α). Expression of CD63 was investigated at the cell
surface using immunofluorescence technique and in subcellular compartments by
pre-embedding ultrastructural immunolabeling which enables better antigenic
preservation. Optimal access of antibodies to cellular microdomains was achieved
with gold particles (1.4 nm) conjugated with secondary antibodies.
Immunofluorescence showed high CD63 expression at cell surface, but with different
profiles, depending on the stimulus. While eotaxin induced a punctual
immunolabeling, expression of CD63, induced by TNF-α, was more diffuse, indicating
occurrence of different secretory processes. Ultrastructural analyses revealed that
eotaxin induced PMD, while TNF-α led to classical exocytosis. CD63 was detected
mainly on secretory granules. Quantitative analyses showed a significant increase of
the numbers of CD63-positive granules compared to the unstimulated, control group.
Moreover, 89.94 % of the granules undergoing PMD (eotaxin group) and 84.73% of
the granules in fusion process (TNF-α group) were positive for CD63. CD63 labeling
was also documented in endosomes and vesicles, including tubular vesicles typical
of eosinophils (Eosinophil Sombrero Vesicles – EoSVs), involved in the transport of
granule molecules. Altogether, our data demonstrated, for the first time, that CD63 is
a marker for secretory granules as well as for secretory processes involved with the
release of products from eosinophils. This is important for understanding
mechanisms of secretion of immune mediators during inflammatory responses of
eosinophils to allergic and inflammatory diseases.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/12865 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Carmo, Lívia Andressa Silva do |
| Contributors | Faria, Suzana Corte Real, Neves, Josiane Sabbadini, Elsas, Pedro Paulo Xavier, Souza, Mirian Claudia de, Parreira, Gleydes Gamboli, Melo, Rossana Correa Netto de |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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