Embora a citricultura seja uma importante atividade econômica no Brasil, nos últimos anos houve uma redução significativa da produção nacional. A baixa rentabilidade que o setor citrícola vem enfrentando, devido ao alto custo de produção, é decorrente principalmente dos problemas fitossanitários, com destaque para as doenças, que afetam diretamente a produtividade dos pomares. Atualmente, o huanglongbing (HLB) é a doença mais grave que afeta a citricultura mundial, sendo que os danos são severos em todas as variedades de citros. Diante desse fato, a transformação genética de plantas é uma alternativa para a obtenção de plantas transgênicas, com genes que estimulem o sistema de defesa das plantas, tornando-as resistentes a doenças. Apesar da eficácia dos protocolos existentes para a transformação genética de citros, uma desvantagem característica de plantas perenes é o ciclo reprodutivo lento, tornando difícil e demorado a validação de novos genes de interesse. Por isso, uma importante estratégia é o uso de plantas modelos, como o tomateiro, que possui ciclo curto e boa eficiência de transformação genética. Assim, o objetivo deste trabalho foi obter plantas transgênicas de Solanum lycopersicum cv. \'Micro-Tom\' e Citrus sinensis, contendo a construção gênica com o gene Csd1 (superóxido dismutase do cobre e do zinco), isolado de Poncirus trifoliata. A proteína codificada pelo gene Csd1, também conhecido como Sod1 (superoxide dismutase 1), é o mais potente antioxidante na natureza e é um importante constituinte de defesa celular contra o estresse oxidativo causado pela infecção bacteriana. O tomateiro Micro-tom foi utilizado como modelo de patogenicidade para validação do gene. Porém, devido a sua baixa eficiência de transformação genética, os experimentos de inoculação com o patógeno não foram realizados. Posteriormente, a caracterização da função do gene Csd1 em relação ao HLB será realizada com as plantas transgênicas de citros. A identificação de plantas transgênicas, de tomate e de laranja doce, foi realizada por meio da análise de PCR, utilizando primers para a detecção do gene Csd1. As plantas PCR+ foram aclimatizadas e transferidas para casa-de-vegetação. A eficiência de transformação genética do tomateiro \'Micro-Tom\' e das cultivares de laranja doce, \'Hamlin\' e \'Pineapple\', foram respectivamente: 0,34%, 4,74% e 3,65%. A caracterização molecular pelas análises de Southern blot e RT-qPCR foi realizada apenas em plantas de citros. Foi possível confirmar a integração do transgene em 32 eventos obtidos. O número de eventos de inserção variou de 1 - 5, sendo a presença do gene endógeno Csd1, localizada em 3 locais distintos no genoma das plantas. O nível de mRNA do transgene foi verificada em 21 plantas que tiveram apenas uma única inserção do transgene no genoma. Os resultados obtidos mostram que houve transcrição do gene Csd1 nas plantas transgênicas, assim como, na testemunha não transgênica. A relação do nível de transcrição do transgene com a resistência das plantas ao patógeno será definida após a inoculação com Candidadus Liberibacter. / Although the citrus industry is an important economic activity in Brazil, in recent years there has been a significant reduction in the national citrus production. The low profitability of the citrus sector has faced due to the high production cost is mainly attributed to phytosanitary problems, particularly diseases that directly affect productivity of orchards. Currently, huanglongbing (HLB) is the most serious disease that affects the global citrus industry and the damage is severe in all citrus varieties. Genetic transformation of plants is an alternative to obtain transgenic plants with genes that stimulate the plant defense system, making it resistant to diseases. Despite the effectiveness of protocols for genetic transformation of citrus, a characteristic disadvantage of perennial plants is the slow reproductive cycle, hindering validation of new genes of interest. Therefore, an important strategy is the use of model plants, such as the tomato, which has a short cycle and good genetic transformation efficiency. The objective of this study was to obtain transgenic plants of Solanum lycopersicum cv. \"Micro-Tom \'and Citrus sinensis, containing the gene construct with Csd1 gene (copper/zinc superoxide dismutase), isolated of Poncirus trifoliata. The protein encoded by the gene Csd1, also known as SOD1 (superoxide dismutase 1), is the most powerful antioxidant in nature and is important constituent of cellular defense against oxidative stress caused by bacterial infection. \'Micro-tom\' tomato was used as a model for pathogenic gene validation. However, due to its low efficiency of genetic transformation, the inoculation experiments with the pathogen were not realized. Posteriorly, the characterization of gene function Csd1 in relation to the HLB disease will be realize with citrus transgenic plants. The objective of this study was to obtain transgenic plants of Solanum lycopersicum cv. \'Micro-Tom\' and of Citrus sinensis, containing the gene construction with Csd1 gene (copper/zinc superoxide dismutase), isolated of Poncirus trifoliata, for validation and for future study of this gene for resistance to HLB. Proteins encoded by the Csd1 gene, also known as SOD1 (superoxide dismutase 1), are the most powerful antioxidants in nature and are important constituents of cellular defense against oxidative stress caused by bacterial infection. The identification of transgenic plants of tomato and sweet orange was performed by the PCR analysis using primers for the detection of Csd1 gene. The PCR+ plants were acclimatized and transferred to a greenhouse. The genetic transformation efficiency of tomato \'Micro-Tom\' and sweet orange cultivars, \'Hamlin\' and \'Pineapple\', were 0.34%, 4.74% and 3.65%, respectively. The molecular characterization with the Southern blot and RT-qPCR analyses was performed only in citrus plants. The transgene integration was confirmed in 32 plants. The number of insertion events ranged from 1-5 and the presence of Csd1 endogenous gene is found in three distinct locations in the plants genome. The mRNA level of the transgene was verified in 21 plants that had only a single transgene insertion into the plant genome. The results show that there was transcription of Csd1 gene in transgenic plants as well as in non-transgenic plants. The relation between the transgene transcript level with the resistance of plants to pathogens is set after inoculation with Candidadus Liberibacter.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-14122015-103829 |
| Date | 16 October 2015 |
| Creators | Moraes, Tatiana de Souza |
| Contributors | Mendes, Beatriz Madalena Januzzi |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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