L'instabilité chromosomique, marque des cellules tumorales, peut trouver sa source dans un défaut d'initiation de la réplication. Ceci a été illustré chez la levure Saccharomyces cerevisiae et concorde avec l'observation de mutations de régulateurs de la transition G1/S dans un grand nombre de tumeurs. Toutefois, les mécanismes par lesquels cette instabilité survient n'ont pas encore été clairement définis. Pour résoudre cette question, nous avons utilisé le mutant de levure cdc6-1 où la formation des complexes pré-réplicatifs est graduellement affectée avec l'augmentation de la température. Nous avons mis en évidence que l'allongement de la durée de la réplication qui en suit induit des cassures de l'ADN (DSB) seulement à l'entrée en mitose. Par combinaisons de mutants, nous avons vu que la condensation des chromosomes est en partie responsable de ces DSB. Ces DSB sont signalées à la cellule via la protéine Rad9, protéine adaptatrice du checkpoint de dommages à l'ADN. De façon concordante, nous avons observé une activation de la protéine effectrice de ce checkpoint Rad53 à l'entrée en mitose. La viabilité des cellules cdc6-1 repose sur les protéines de checkpoint Chk1 et Rad53 ainsi que sur la présence de cohésines et des topoisomérases Top2 et Top3. Selon nous, la réplication prolongée par diminution du nombre d'origines n'est pas détectée par les cellules comme un stress réplicatif. Lors de l'entrée en mitose, la condensation des chromosomes transformerait les fourches de réplication en structures reconnues et clivées par les nucléases Mus81-Mms4 et Yen1, qui sont activées en mitose, dirigeant ces régions sous-répliquées vers la réparation par recombinaison. Ce sont les coupures induites en mitose, non la progression des fourches, qui activent le checkpoint. Nous proposons que la sous-réplication de segments d'ADN consécutive à un défaut de licensing des origines favorise la recombinaison non homologue et génère l'instabilité chromosomique, à l'image des sites fragiles communs qui sont le siège de remaniements récurrents lors de la cancérogenèse. / Chromosome instability (CIN), a hallmark of cancer cells, can take its roots in the G1 phase of the cell cycle, when replication origins are licensed. This has been illustrated in the yeast Saccharomyces cerevisiae and is consistent with the fact that a vast number of tumors presents mutations in G1/S transition regulators. However the mechanisms by which this instability occurs are still not well established. Using the yeast cdc6-1 mutant in which preRC formation can be decreased gradually with temperature, we show that cells replicating from fewer origins undergo massive DNA double-strand break (DSB) formation in mitosis. Blocking mitotic entry by Swe1 overexpression or Clb1-4 depletion, and inactivation of Cdc5 (Polo) both suppress DSB formation in cdc6-1 cells, demonstrating that DSBs do not stem from collapsed forks but are actively induced during mitosis. DSB formation is dependent on chromosome condensation and the Mus81-Yen1 structure-specific endonucleases. These DSBs then trigger the Rad9 DNA damage checkpoint. Accordingly, Rad53 phosphorylation is detected only after entry into mitosis. We propose that cells replicating their DNA from fewer origins enter mitosis undetected, then condense their chromosomes and cleave unreplicated regions by Mus81-Yen1 for repair by recombination. The viability of cdc6-1 cells at semi-permissive temperature relies on Chk1 and Rad53, as well as on cohesins and topoisomerases Top2 and Top3. Cleavage of under replicated DNA segments in mitosis may favor non-homologous repair pathways leading to chromosome rearrangements, as seen for common fragile sites that co-localize with recurrent breakpoints in cancer.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2011MON20130 |
| Date | 16 December 2011 |
| Creators | Petit, Julie |
| Contributors | Montpellier 2, Schwob, Étienne |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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