Globalmente ocorrem cerca de 800.000 mortes de crianças menores de cinco anos associadas à diarreia, principalmente na África subsaariana, sul da Ásia e América Latina. Dentre os patógenos causadores de diarreia, Escherichia coli diarreiogênica (DEC) é o agente etiológico bacteriano mais comum, incluindo E. coli enteropatogênica (EPEC) e E. coli produtora da toxina de Shiga e seu subgrupo enterohemorrágica (STEC/EHEC). Os dados epidemiológicos indicam a importância do diagnóstico precoce e sua realização em locais com pouca infraestrutura. Desta forma o objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de um teste rápido, sensível e específico para o diagnóstico de EPEC e STEC/EHEC. Primeiramente, foram definidas diferentes condições do cultivo bacteriano: Dulbecco\'s modified Eagle\'s (DMEM), DMEM contendo 1% de triptona e DMEM pré-condicionado para o cultivo dos isolados de EPEC/EHEC e avaliação da produção/secreção das proteínas secretadas EspA e EspB, utilizando anticorpos monoclonais (MAb) e policlonais (PAb) anti-EspA ou anti-EspB por ELISA indireto. Para a avaliação da liberação das toxinas de Shiga para o sobrenadante do cultivo bacteriano de STEC/EHEC, foram testados diferentes condições de tratamento, o cultivo bacteriano foi tratado com Triton X-100 e o sedimento foi tratado com tampão de lise B-PER utilizando MAb e PAb anti-Stx1 ou anti-Stx2 por ELISA de captura. Subsequentemente, foi desenvolvido e avaliado o teste de aglutinação em látex para a detecção de EspB em isolados de EPEC/EHEC, e Stx1 e Stx2 em isolados de STEC/EHEC. EspB foi definida como biomarcador, o MAb anti-EspB como ferramenta para o diagnóstico de EPEC/EHEC, e a condição ideal para a produção/secreção de EspB foi o cultivo em DMEM. Para o diagnóstico de STEC/EHEC a condição ideal para liberação das toxinas Stx foi o tratamento do cultivo com Triton X-100. Tanto o ELISA, como a aglutinação em látex apresentaram sensibilidades e especificidades exigidas para testes diagnósticos de doenças negligenciadas em países em desenvolvimento e os testes de aglutinação em látex para a detecção destes patógenos foram precisos, rápidos e fáceis de executar, sendo portanto promissores para a utilização em laboratórios com mínima infraestrutura. / There are 800,000 deaths associated with diarrhea worldwide in children under five, and these are mainly in sub-Saharan Africa, Southeast Asia and Latin America. Among the causative pathogens of diarrhea, diarrheagenic Escherichia coli (DEC) is the most common bacterial etiological agent, including enteropathogenic E. coli (EPEC) and Shiga toxin-producing E. coli and its subgroup enterohemorrhagic E. coli (STEC/EHEC). Epidemiological data indicate the importance of early diagnosis and its realization in places with limited resources. Therefore, the objective of this work was to develop a rapid, sensitive and specific test for the diagnosis of EPEC and STEC/EHEC. First, different bacterial growth conditions were evaluated: Dulbecco\'s modified Eagle\'s medium (DMEM) or DMEM containing 1% tryptone, and DMEM pre-conditioned with EPEC/EHEC isolates. The production/secretion of the secreted proteins EspA and EspB was determined by indirect ELISA utilizing anti-EspA or anti-EspB monoclonal (MAb) and polyclonal (PAb) antibodies. Different treatments were tested for their effect on the release of Shiga toxins into the medium of STEC/EHEC bacterial cultures. The bacterial culture supernatant was treated with Triton X-100, and the sediment was treated with B-PER lysis buffer. The toxins release was determined by capture ELISA using anti-Stx1 or anti-Stx2 MAb and PAb. Subsequently, a latex agglutination test was developed and evaluated for the detection of EspB in EPEC/EHEC isolates and of Stx1 and Stx2 in STEC/EHEC isolates. EspB was defined as the biomarker and anti-EspB MAb as the tool for the diagnosis of EPEC/EHEC. The ideal conditions for the production/secretion of EspB were cultivation in DMEM. For the diagnosis of STEC/EHEC, the ideal conditions for the release of Stx were Triton X-100 treatment. ELISA as well as latex agglutination showed the sensitivities and specificities required for diagnostic tests of neglected diseases in developing countries. The latex agglutination test for the detection of these pathogens was precise, rapid and easy to perform, thereby being promising for their utilization in laboratories with limited resources.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-04032016-133533 |
| Date | 09 May 2014 |
| Creators | Santos, Anna Raquel Ribeiro dos |
| Contributors | Piazza, Roxane Maria Fontes |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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