A Na,K-ATPase é uma proteína integral que utiliza a energia derivada da hidrólise do ATP para transportar íons Na+ e K+ através da membrana contra seus gradientes eletroquímicos. É composta por três subunidades, denominadas alfa, beta e gama. Alguns autores defendem que o protômero (alfa-beta) seja a unidade estrutural e funcional da enzima, porém outros consideram que a enzima nativa da membrana funciona como um oligômero, na forma de um dímero (alfa-beta)2. Em estudos com proteínas de membrana, o uso de detergentes é bastante comum para manter a proteína de interesse em um estado funcional após ser retirada da bicamada lipídica, além disso, sabe-se que vários fatores interferem a atividade enzimática da Na,K-ATPase e existem evidências que mostram que a bicamada lipídica, na qual a enzima está inserida, também controla a interação entre os protômeros da proteína e alterações nas suas propriedades biofísicas podem modular a atividade da enzima. O objetivo do trabalho foi verificar o efeito de diferentes razões detergente/proteína na estabilidade da Na,K-ATPase solubilizada e de diferentes microambientes lipídicos na sua atividade, analisando as alterações no comportamento termotrópico da bicamada com a mudança da composição lipídica, observando as alterações da incorporação e recuperação da atividade enzimática quando a proteína foi reconstituída em sistemas miméticos de membrana. Utilizando o espalhamento dinâmico de luz (DLS) foi possível acompanhar o processo de agregação térmica da enzima, fornecendo informações da sua estrutura, bem como avaliar a sua estabilidade quando solubilizada. A desnaturação térmica da Na,K-ATPase também foi avaliada por calorimetria diferencial de varredura (DSC) e verificou-se que é um processo irreversível, e ocorreu entre 50 e 70°C, sendo a soma de três transições. Utilizando DSC, analisou-se ainda o comportamento termotrópico dos sistemas de lipossomos e proteolipossomos constituídos de DPPC, DPPE e colesterol. Para os sistemas vesiculares, na ausência da proteína, foi observado que para o sistema binário de DPPC e DPPE, o aumento da proporção do último lipídio induz uma separação de fase, assim como a presença de colesterol, tanto nos sistemas binários (DPPC:Col e DPPE:Col), quanto no ternário (DPPC:DPPE:Col). Avaliou-se ainda como o microambiente lipídico interfere na incorporação e atividade da Na,K-ATPase. Verificou que diferentes quantidades de colesterol alteram a atividade enzimática, confirmando que este possui um importante papel na modulação da atividade, alterando propriedades da membrana e influenciando na conformação da proteína. / Na,K-ATPase is an enzyme that is intrinsic to the plasma membrane, responsible for the coupled active transport of Na+ and K+ across animal cell membranes. The enzyme consists of alfa, beta and gama subunits. It has been demonstrated that the alfa-beta form of Na,K-ATPase is capable of both ATP hydrolysis and active ion transport, however accumulating evidence suggest that the enzyme normally self-associates as (alfa-beta)2 dimers. In membrane protein research, the most typical use of a detergent is to maintain a target membrane protein in a functional, folded state in the absence of a membrane. Moreover, it is known that several factors influence the enzymatic activity of Na, K-ATPase and there is evidence that the lipid bilayer, in which the enzyme is located, also controls the interaction between protomers and that changes in their biophysical properties can modulate the activity of the enzyme. The objective of this study was to investigate the effect of different detergent/protein ratios on the stability solubilized of Na, K-ATPase and different lipid microenvironments in their activity by analyzing changes in the thermotropic behavior of the bilayer, analysing the incorporation changes and the recovery of enzyme activity when the protein was reconstituted in a membrane mimetic systems. Dynamic light scattering (DLS) was used to monitor the process of thermal aggregation of the enzyme, providing information on their structure and evaluating its stability when solubized. The thermal denaturation of Na, K-ATPase was also evaluated by differential scanning calorimetry (DSC) and it was verified that it is an irreversible process, which occurred between 50 and 70 ° C, being the sum of three transitions. Using DSC, we analyzed the thermotropic behavior of proteolipossomos and liposomes consisting of DPPC, DPPE and cholesterol. For vesicular systems in the absence of the protein, it was observed that for the binary system of DPPC and DPPE, increasing the proportion of the latter induces a lipid phase separation and the presence of cholesterol in both binary systems (DPPC: Col and DPPE: Chol), and in the ternary system (DPPC: DPPE: Chol) it induces a lipid phase separation. It was also evaluated how the lipid microenvironment interferes on the incorporation and activity of Na, K-ATPase. It was found that different amounts of cholesterol alter the enzyme activity, confirming cholesterol has an important role in the modulation of the activity by altering the membrane properties and influencing the protein conformation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-08062010-093348 |
| Date | 03 March 2010 |
| Creators | Juliana Sakamoto Yoneda |
| Contributors | Pietro Ciancaglini, Iolanda Midea Cuccovia, Rosa dos Prazeres Melo Furriel Inocentes |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Química, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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