A liberação controlada de fármacos é um tópico importante para várias iniciativas em nanotecnologia devido ao possível impacto para a sociedade, com a criação de sistemas otimizados que garantam a liberação num sítio específico e a uma taxa controlada. Dentre os vários paradigmas de liberação controlada destaca-se o uso de lipossomos, uma vez que muitos fármacos e drogas podem ser transportados. Este trabalho descreve a fabricação de filmes automontados de lipossomos que incorporam o fármaco ibuprofeno. Os lipossomos foram preparados de dipalmitoil fosfatidil colina (DPPC), dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG) e palmitoil-oleoil fosfatidil glicerol (POPG), cujas camadas foram alternadas por interações eletrostáticas com camadas do dendrímero PAMAM geração 4. Medidas de espalhamento dinâmico de luz indicaram que a incorporação do ibuprofeno tornou os lipossomos de DPPC e DPPG mais estáveis, com uma diminuição no diâmetro médio de 140 para 74 nm e 132 para 63nm, respectivamente. Ao contrário, os lipossomos de POPG ficaram menos estáveis, com aumento do diâmetro de 110 para 160 nm. A influência na estabilidade foi confirmada em medidas de microscopia de força atômica nos filmes automontados, que mostraram grande tendência à ruptura nos lipossomos de POPG com a incorporação de ibuprofeno. O crescimento dos filmes automontados foi investigado com espectroscopia de fluorescência e uma balança de cristal de quartzo. A intensidade da fluorescência devida ao ibuprofeno aumentou exponencialmente com o número de camadas depositadas, mas não por causa de uma crescente adsorção de ibuprofeno. Ao contrário, a quantidade de material adsorvido nas primeiras camadas aumentou inicialmente, mas depois diminuiu drasticamente após a 6ª. bicamada, e o filme praticamente pára de crescer a partir da 10ª. bicamada. Portanto, a grande fluorescência para filmes espessos deve ser associada a um ambiente favorável, que aumenta a emissão quântica do ibuprofeno. A liberação do ibuprofeno, estudada com medidas de fluorescência, é mais lenta quando incorporado em lipossomos. Em experimentos com uma membrana de diálise, notamos que o tempo de decaimento do ibuprofeno puro é 5,2 h, enquanto este tempo aumentou para 9,2 e 8 h para ibuprofeno encapsulado em lipossomos de DPPG e POPG, respectivamente. O ibuprofeno também foi liberado de filmes automontados contendo lipossomos de DPPG e POPG, o que é promissor para o uso em bandagens (patches). / Controlled drug delivery is a key issue in a number of nanotechnology endeavors owing to the large impact on society that may achieved if improved systems are created which allows for delivery at a specific target and with a controlled rate. Among the various paradigms employed in drug delivery, the use of liposomes is prominent because a variety of drug molecules can be carried. This work describes the fabrication of layer-by-layer (LbL) films made with liposomes incorporating ibuprofen. The liposomes were made with dipalmitoyl phosphatidyl choline (DPPC), dipalmitoyl phosphatidyl glycerol (DPPG) and palmitoyl-oleoyl-phosphatidyl glycerol (POPG), whose layers were alternated with layers of the dendrimer PAMAM generation 4 via electrostatic interactions. According to dynamic light scattering measurements, the incorporation of ibuprofen caused DPPC and DPPG liposomes to become more stable, with a decrease in diameter from 140 to 74 nm and from 132 to 63 nm, respectively. In contrast, liposomes from POPG became less stable, with an increase in size from 110 to 160 nm. These results were confirmed with atomic force microscopy images of LbL films, which showed a large tendency to rupture for POPG liposomes. The film growth was monitored with fluorescence spectroscopy and a quartz crystal microbalance (QCM). The fluorescence intensity arising from ibuprofen increased exponentially with the number of layers, but this was not caused by an increased adsorption of ibuprofen. Instead, the QCM measurements showed that the amount of material adsorbed increases initially with the number of PAMAM/liposome(ibuprofen) layers, but after the 6th bilayer it decreases sharply and film growth practically stops after the 10th layer. Therefore, the inevitable conclusion is that the increased fluorescence is due to a favorable environment for the ibuprofen, whose quantum emission efficiency increases with the number of layers deposited. Also using fluorescence measurements, we noted that release of ibuprofen was delayed when incorporated in liposomes. For instance, in a membrane dialysis experiment, the characteristic decay time was 3.5 h for ibuprofen in solution, whereas this time increased to 9.2 and 8 h for ibuprofen encapsulated into DPPG and POPG liposomes, respectively. Ibuprofen could also be released from the LbL films made with DPPG and POPG liposomes, which is promising for further use in patches.

A organização da membrana biológica em microdomínios tem um papel chave em vários processos celulares semelhante a receptores protéicos e a transdução de sinal. A existência de microdomínios, também denominados de rafts tem sido explicada pela separação das membranas lipídicas em duas fases: liquida cristalina (L) e fase liquida ordenada (Lo) rica em colesterol e esfingolipídeos. Assim, o enfoque deste projeto foi correlacionar mecanismos de controle da atividade da fosfatase alcalina (TNAP) com a organização intermolecular e o estado de fase de alguns lipídios que compõem as vesículas da matrix. Foi estudada a modulação da atividade da enzima e sua inserção à sistemas de lipossomos constituídos com diferentes composições lipídicas (Dipalmitoilfosfatidilcolina, Colesterol, Esfingomielina e Gangliosídeo) como um mecanismo de regulação e transdução entre enzimas que não compartilham intermediários metabólicos comuns. Isto é, verificar como mudanças de organização molecular, induzida por colesterol e/ou outros lipídios, podem modular a atividade de enzimas regulando a produção de mensageiros lipídicos secundários e/ou processos de fusão e recombinação topológica da bicamada lipídica, modulando concomitantemente a atividade da fosfatase alcalina. Com tal propósito, a TNAP foi reconstituída em lipossomos constituídos de DPPC e lipossomos mistos formando sistemas binários DPPC:Chol, DPPC:SM e DPPC:GM1 com razões molares de (9:1); sistemas terciários DPPC:Chol:SM, DPPC:Chol:GM1 e DPPC:SM:GM1 com razões molares de (8:1:1) e por fim sistemas quaternários constituídos de DPPC:Chol:SM:GM1 (7:1:1:1). Estes sistemas foram propostos com o intuito de mimetizarmos os lipid rafts existentes nas membranas biológicas, porém utilizando lipídios que já foram identificados e quantificados nas vesículas da matrix. Foram avaliados os efeitos da composição lipídica dos lipossomos na inserção da enzima aos sistemas vesiculares. Além disso, foram realizados estudos biofísicos de calorimetria analisando como os parâmetros termodinâmicos são afetados com as diferentes composições lipídicas e pela presença da enzima ancorada aos sistemas. A reconstituição da enzima a lipossomos constituídos de DPPC proporcionou uma incorporação em torno de 80% da atividade enzimática. Estudos termodinâmicos dos proteolipossomos formados evidenciaram uma queda significativa nos valores de variação de entalpia em relação aos sistemas de lipossomos (de 7,63 a 1,88 kcal.mol-1). Lipossomos binários constituídos de DPPC:Chol em concentrações crescentes (9:1, 9:2, 9:3, 7:3, 9:4 e 9:5 razão molar) foram estudados tanto pelos parâmetros biofísicos como pela habilidade de inserção da enzima a tais sistemas. Foi observado um significativo decréscimo nos valores de variação entalpia com o aumento da proporção de colesterol no lipossomo. Além disso, a presença do colesterol proporcionou uma redução na inserção da atividade catalítica em até 42%, quando utilizada a composição lipídica de 9:5 DPPC:Chol. Dos sistemas binários formados com razões molares 9:1, o que apresentou maior porcentagem de reconstituição da TNAP foi o sistemas DPPC:Chol, apresentando em torno de 62% de incorporação da enzima. Os sistemas terciários apresentaram ao redor de 30% de incorporação da atividade catalítica e o sistema quaternário em torno de 25%. Além dos ensaios de atividade enzimática, a incorporação da enzima aos sistemas vesiculares também pôde ser comprovada pelas mudanças nos parâmetros termodinâmicas detectados por DSC. Nos estudos de calorimetria de todos os sistemas de proteolipossomos formados, foram observadas significativas diminuições nos valores de variação de entalpia quando comparados aos sistemas de lipossomos correspondentes. Deste modo, os resultados aqui apresentados fornecem novas informações que poderão contribuir tanto para a compreensão do comportamento da atividade da fosfatase alcalina na presença de diferentes composições lipídicas dos microdomínios existente membrana, quanto para o entendimento dos processos de regulação da enzima durante o processo de biomineralização. / The organization of the biological membrane in microdomains has a key roll in many cellular processes similar to proteic receptors and signal transduction. The existence of microdomains, also called rafts, has been explained by the lipid membrane separation in two phases: crystalline phase (L) and ordinate liquid phase (Lo), rich in cholesterol and sphingolipids. The focus of this Project was to correlate activity control mechanisms of the alkaline phosphatase (TNAP) with the intermolecular organization and the phase stat of some lipids that comprise the matrix vesicles. The enzyme activity modulation and its insertion into liposomes systems, constituted by different lipid compositions (DPPC, Chol, SM e GM1) as a regulation and transduction mechanism between enzymes that do not share common intermediary metabolites, was studied. That is, to verify how molecular organization changes, induced by cholesterol and/or other lipids, can modulate the enzyme activity regulating the production of secondary lipid messengers and/or fusion processes and topological recombination of the lipidic bilayer, concomitantly modeling the alkaline phosphatase activity. TNAP was then reconstituted in liposomes constituted by DPPC and mixed liposomes forming binary systems DPPC:Chol , DPPC:SM , DPPC: Chol:GM1 with (9:1) molar rates; tertiary systems DPPC:Chol:SM, DPPC:Chol:GM1 and DPPC:SM:GM1 with (8:1:1) molar rates and finally quaternary system constituted by DPPC:Chol:SM:GM1 (7:1:1:1). These systems were proposed aiming the mimetization of lipid rafts existent in biological membranes, but using lipids that had already been identified and quantified in the matrix vesicles. The effects of liposome lipid composition in the enzyme insertion to the vesicular systems were assayed. Besides that, calorimetry biophysical studies were done analyzing how the thermodynamic parameters are affected by the different lipid compositions e by the presence of the systems anchored enzyme. The enzyme reconstruction to the DPPC constituted liposomes has provided an incorporation of around 80% of the enzyme activity. Thermodynamic studies of the proteoliposomes formed have shown a significant decrease in the H values in relation to the liposomes systems (from 7.63 to 1.88 kcal.mol-1). Binary liposomes constituted of DPPC:Chol in increasing concentrations (9:1, 9:2, 9:3, 7:3, 9:4 e 9:5 molar ratio) were studied by the biophysical parameters as well as by the insertion ability of the enzyme into those systems. A significant decrease in the enthalpy values with the increase of the cholesterol proportion in the liposome was observed. Besides that, the presence of cholesterol has allowed a reduction in the insertion of the catalytic activity in up to 42% when the lipid composition 9:5 DPPPC:Chol was used. Among the binary systems formed with molar ratios of 9:1, the one which showed the highest percentage of TNAP reconstitution was the DPPC:Chol system, with around 62% enzyme incorporation. The tertiary systems had around 30% incorporation of the catalytic activity, and the quaternary system around 25%. Besides the enzymatic activity assays, the enzyme incorporation to the vesicular systems can also be verified by the thermodynamic parameters change detected by DSC. In the calorimetry studies of all the proteoliposomes formed, significant decreases in the enthalpy values were observed when compared to the corresponding liposomes systems. Thereby, the results presented here provide new information that can contribute to understand the alkaline phosphatase behavior in the presence of different microdomain lipid compositions existent in the membrane, as well as understanding the regulation processes of the enzyme during the biomineralization process.

Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de biossensores eletroquímicos baseados na imobilização de duas enzimas diferentes em filmes de polipirrol (PPI) eletrodepositados, a fitase e a polifenol oxidase (PFO), esta última na forma de extrato bruto do fruto de abacate. Como a fitase hidrolisa cataliticamente ácido fítico (AF) em íons fosfatos, foram preparados biossensores por imobilização da enzima sobre filmes de PPI para a detecção indireta de ácido fítico via íons fosfatos. Foram utilizados dois métodos de imobilização; no primeiro, a enzima, fitase, foi imobilizada ao filme de PPI por imersão do filme em uma solução contendo a enzima por um período de 2 h, no segundo, a fitase foi encapsulada em lipossomos de dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG) e depois foi imobilizada nos filmes de PPI depositados em eletrodos impressos. O segundo método se mostrou melhor para a detecção de ácido fítico, pois levou a um maior alcance linear e um baixo valor de limite de detecção. Neste caso, verificou-se que o DPPG preservou a integridade enzimática e levou a biossensores mais estáveis e sensíveis. Já para a PFO, que catalisa a oxidação de compostos fenólicos a quinonas, foram preparados biossensores para a detecção indireta de catecol. Para esta enzima, foram utilizados três métodos de imobilização: adsorção, ligação cruzada e confinamento, sendo o último que levou a melhores respostas. O método de confinamento consiste na adição da enzima, juntamente com o monômero, à solução de eletropolimerização, quando se procede com a metodologia normal de preparo dos filmes de PPI, que foram caracterizados por: microscopia de força atômica (AFM), microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) e espectroscopia de reflexão e absorção no infravermelho com modulação da polarização (PM-IRRAS). Estas técnicas de caracterização permitiram com que a presença da enzima fosse associada às modificações das características estruturais e morfológicas dos filmes de PPI. / This doctoral thesis reports on the development of electrochemical biosensors based on the immobilization of enzymes phytase and polyphenol oxidase (PPO) (the latter in the form of crude extract of avocado fruit) on electrodeposited polypyrrole films (PPY). As phytase catalytically hydrolyzes phytic acid (PA) in phosphate ions, biosensors were prepared by its immobilization on PPY films for the indirect detection of PA via phosphate ions. In the first method the enzyme was maintained on the PPY film for a period of 2 h, whereas in the second, it was encapsulated in Dipalmitoyl Phosphatidyl glycerol (DPPG) and immobilized on printed electrodes. The second system proved more viable for the detection of PA and showed broader linear range and low detection limit because DPPG preserved the integrity of the enzyme and produced more stable and sensitive biosensors. Regarding PPO, which catalyzes the oxidation of phenolic compounds to quinones, biosensors for the indirect detection of catechol via the formation of quinone in solution were prepared. Three methods of immobilization were used: adsorption, cross-linking and confinement. The latter yielded favorable results in comparison to other methods. The films were characterized by atomic force microscopy (AFM), scanning electron microscopy (SEM) spectroscopy, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and reflection absorption and infrared polarization modulation (PM-IRRAS) techniques and revealed the presence of the enzyme and a modification in the structural characteristics and morphology of the films.

O uso da elevação da temperatura local como recurso adjuvante no combate ao câncer tem sido explorado intensamente nas últimas décadas. A hipertermia, como é chamada essa elevação de temperatura local, apresenta seu maior potencial clínico quando combinada com a quimioterapia e/ou radioterapia, sendo capaz de promover benefícios terap êuticos significativos. Apesar dos resultados positivos, a hipertermia, até o momento, não se estabeleceu como terapia padrão, devido a limitações no controle da deposição de energia e no monitoramento da distribuição de temperatura em tempo real. Neste trabalho, discutem-se características fundamentais da eficiência da hipertermia no tratamento de tumores cerebrais e de bexiga. O projeto foi todo ele desenvolvido em colaboração com o grupo de hipertermia do Department of Radiation Oncology da Duke University. Com relação à hipertermia aplicada ao cérebro, primeiramente apresenta-se o procedimento de desenvolvimento e teste de eficiência de um mini-aplicador de micro-onda dedicado ao aquecimento do cérebro de camundongos. Após estes, avaliou-se a capacidade de disponibilização termo-estimulada da doxorrubicina a modelos tumorais de glioblastoma. O método utilizado para monitoramento da liberação e distribuição da doxorrubicina foi a microscopia confocal de fluorescência intravital. O estudo do impacto da hipertermia sob a distribuição da formulação de doxorrubicina encapsulada em lipossomos termosensíveis demonstrou que a elevação moderada de temperatura promove alterações significativas na permeabilidade da barreira hematoencefálica, além de promover aumento do acúmulo total de droga e aumento no grau de penetração. Para a hipertermia aplicada à bexiga, apresenta-se um estudo de viabilidade de aquecimento para uma metodologia alternativa ao dispositivo de uso clínico padrão (_Synergo_), denominada magneto-hipertermia. Os ensaios com a magneto-hipertermia apontam que o uso de nanopartículas magnéticas sob influência de um campo magnético alternado (40 kHz) é capaz de elevar a temperatura do lúmen da bexiga a 42_C de forma localizada, não promovendo efeitos significativos de aquecimento a tecidos do entorno. / The use of local heating to achieve adjuvant response in cancer treatment has been widely explored in the last decades. The thermal therapy has a well-known clinical bene_t when combined to chemotherapy and/or radiotherapy. Despite all positive results, the use of thermal therapy has not yet been established as standard treatment, mainly due to the limitation on the control of energy deposition and real-time temperature mapping. This thesis discuss some of the fundamentals of the application of hyperthermia to treat bladder and brain tumors. All experiments were performed in collaboration with the Department of Radiation Oncology of Duke University. As regards brain experiments, we developed and built a microwave antenna dedicated to locally heating the mouse brain. After that, we assessed the ability of thermo release and thermo delivery of doxorubicin to glioblastoma tumor models. Intravital confocal fluorescence microscopy was used to monitor the drug release and distribution into brain tissue as a whole. Our findings indicated that a mild elevation in brain temperature (42_C) modulates the permeability of the blood-brain barrier and promotes an increase on both total drug accumulation and drug penetration. Concerning bladder hyperthermia, we investigated the feasibility of magnetic-hyperthermia as an alternative heating source to the standard clinical device (_Synergo_). The magnetic-hyperthermia results indicate that the amount of heat dissipation by the magnetic nanoparticles, under the influence of alternating magnetic field (40KHz), was able to raise the temperature in the bladder lumen to 42_C and did not promote any significant heating effects on surrounding tissues.

A Na,K-ATPase é uma proteína integral que utiliza a energia derivada da hidrólise do ATP para transportar íons Na+ e K+ através da membrana contra seus gradientes eletroquímicos. É composta por três subunidades, denominadas alfa, beta e gama. Alguns autores defendem que o protômero (alfa-beta) seja a unidade estrutural e funcional da enzima, porém outros consideram que a enzima nativa da membrana funciona como um oligômero, na forma de um dímero (alfa-beta)2. Em estudos com proteínas de membrana, o uso de detergentes é bastante comum para manter a proteína de interesse em um estado funcional após ser retirada da bicamada lipídica, além disso, sabe-se que vários fatores interferem a atividade enzimática da Na,K-ATPase e existem evidências que mostram que a bicamada lipídica, na qual a enzima está inserida, também controla a interação entre os protômeros da proteína e alterações nas suas propriedades biofísicas podem modular a atividade da enzima. O objetivo do trabalho foi verificar o efeito de diferentes razões detergente/proteína na estabilidade da Na,K-ATPase solubilizada e de diferentes microambientes lipídicos na sua atividade, analisando as alterações no comportamento termotrópico da bicamada com a mudança da composição lipídica, observando as alterações da incorporação e recuperação da atividade enzimática quando a proteína foi reconstituída em sistemas miméticos de membrana. Utilizando o espalhamento dinâmico de luz (DLS) foi possível acompanhar o processo de agregação térmica da enzima, fornecendo informações da sua estrutura, bem como avaliar a sua estabilidade quando solubilizada. A desnaturação térmica da Na,K-ATPase também foi avaliada por calorimetria diferencial de varredura (DSC) e verificou-se que é um processo irreversível, e ocorreu entre 50 e 70°C, sendo a soma de três transições. Utilizando DSC, analisou-se ainda o comportamento termotrópico dos sistemas de lipossomos e proteolipossomos constituídos de DPPC, DPPE e colesterol. Para os sistemas vesiculares, na ausência da proteína, foi observado que para o sistema binário de DPPC e DPPE, o aumento da proporção do último lipídio induz uma separação de fase, assim como a presença de colesterol, tanto nos sistemas binários (DPPC:Col e DPPE:Col), quanto no ternário (DPPC:DPPE:Col). Avaliou-se ainda como o microambiente lipídico interfere na incorporação e atividade da Na,K-ATPase. Verificou que diferentes quantidades de colesterol alteram a atividade enzimática, confirmando que este possui um importante papel na modulação da atividade, alterando propriedades da membrana e influenciando na conformação da proteína. / Na,K-ATPase is an enzyme that is intrinsic to the plasma membrane, responsible for the coupled active transport of Na+ and K+ across animal cell membranes. The enzyme consists of alfa, beta and gama subunits. It has been demonstrated that the alfa-beta form of Na,K-ATPase is capable of both ATP hydrolysis and active ion transport, however accumulating evidence suggest that the enzyme normally self-associates as (alfa-beta)2 dimers. In membrane protein research, the most typical use of a detergent is to maintain a target membrane protein in a functional, folded state in the absence of a membrane. Moreover, it is known that several factors influence the enzymatic activity of Na, K-ATPase and there is evidence that the lipid bilayer, in which the enzyme is located, also controls the interaction between protomers and that changes in their biophysical properties can modulate the activity of the enzyme. The objective of this study was to investigate the effect of different detergent/protein ratios on the stability solubilized of Na, K-ATPase and different lipid microenvironments in their activity by analyzing changes in the thermotropic behavior of the bilayer, analysing the incorporation changes and the recovery of enzyme activity when the protein was reconstituted in a membrane mimetic systems. Dynamic light scattering (DLS) was used to monitor the process of thermal aggregation of the enzyme, providing information on their structure and evaluating its stability when solubized. The thermal denaturation of Na, K-ATPase was also evaluated by differential scanning calorimetry (DSC) and it was verified that it is an irreversible process, which occurred between 50 and 70 ° C, being the sum of three transitions. Using DSC, we analyzed the thermotropic behavior of proteolipossomos and liposomes consisting of DPPC, DPPE and cholesterol. For vesicular systems in the absence of the protein, it was observed that for the binary system of DPPC and DPPE, increasing the proportion of the latter induces a lipid phase separation and the presence of cholesterol in both binary systems (DPPC: Col and DPPE: Chol), and in the ternary system (DPPC: DPPE: Chol) it induces a lipid phase separation. It was also evaluated how the lipid microenvironment interferes on the incorporation and activity of Na, K-ATPase. It was found that different amounts of cholesterol alter the enzyme activity, confirming cholesterol has an important role in the modulation of the activity by altering the membrane properties and influencing the protein conformation.

Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de biossensores eletroquímicos baseados na imobilização de duas enzimas diferentes em filmes de polipirrol (PPI) eletrodepositados, a fitase e a polifenol oxidase (PFO), esta última na forma de extrato bruto do fruto de abacate. Como a fitase hidrolisa cataliticamente ácido fítico (AF) em íons fosfatos, foram preparados biossensores por imobilização da enzima sobre filmes de PPI para a detecção indireta de ácido fítico via íons fosfatos. Foram utilizados dois métodos de imobilização; no primeiro, a enzima, fitase, foi imobilizada ao filme de PPI por imersão do filme em uma solução contendo a enzima por um período de 2 h, no segundo, a fitase foi encapsulada em lipossomos de dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG) e depois foi imobilizada nos filmes de PPI depositados em eletrodos impressos. O segundo método se mostrou melhor para a detecção de ácido fítico, pois levou a um maior alcance linear e um baixo valor de limite de detecção. Neste caso, verificou-se que o DPPG preservou a integridade enzimática e levou a biossensores mais estáveis e sensíveis. Já para a PFO, que catalisa a oxidação de compostos fenólicos a quinonas, foram preparados biossensores para a detecção indireta de catecol. Para esta enzima, foram utilizados três métodos de imobilização: adsorção, ligação cruzada e confinamento, sendo o último que levou a melhores respostas. O método de confinamento consiste na adição da enzima, juntamente com o monômero, à solução de eletropolimerização, quando se procede com a metodologia normal de preparo dos filmes de PPI, que foram caracterizados por: microscopia de força atômica (AFM), microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) e espectroscopia de reflexão e absorção no infravermelho com modulação da polarização (PM-IRRAS). Estas técnicas de caracterização permitiram com que a presença da enzima fosse associada às modificações das características estruturais e morfológicas dos filmes de PPI. / This doctoral thesis reports on the development of electrochemical biosensors based on the immobilization of enzymes phytase and polyphenol oxidase (PPO) (the latter in the form of crude extract of avocado fruit) on electrodeposited polypyrrole films (PPY). As phytase catalytically hydrolyzes phytic acid (PA) in phosphate ions, biosensors were prepared by its immobilization on PPY films for the indirect detection of PA via phosphate ions. In the first method the enzyme was maintained on the PPY film for a period of 2 h, whereas in the second, it was encapsulated in Dipalmitoyl Phosphatidyl glycerol (DPPG) and immobilized on printed electrodes. The second system proved more viable for the detection of PA and showed broader linear range and low detection limit because DPPG preserved the integrity of the enzyme and produced more stable and sensitive biosensors. Regarding PPO, which catalyzes the oxidation of phenolic compounds to quinones, biosensors for the indirect detection of catechol via the formation of quinone in solution were prepared. Three methods of immobilization were used: adsorption, cross-linking and confinement. The latter yielded favorable results in comparison to other methods. The films were characterized by atomic force microscopy (AFM), scanning electron microscopy (SEM) spectroscopy, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and reflection absorption and infrared polarization modulation (PM-IRRAS) techniques and revealed the presence of the enzyme and a modification in the structural characteristics and morphology of the films.

A Na,K-ATPase é uma proteína integral que utiliza a energia derivada da hidrólise do ATP para transportar íons Na+ e K+ através da membrana contra seus gradientes eletroquímicos. É composta por três subunidades, denominadas alfa, beta e gama. Alguns autores defendem que o protômero (alfa-beta) seja a unidade estrutural e funcional da enzima, porém outros consideram que a enzima nativa da membrana funciona como um oligômero, na forma de um dímero (alfa-beta)2. Em estudos com proteínas de membrana, o uso de detergentes é bastante comum para manter a proteína de interesse em um estado funcional após ser retirada da bicamada lipídica, além disso, sabe-se que vários fatores interferem a atividade enzimática da Na,K-ATPase e existem evidências que mostram que a bicamada lipídica, na qual a enzima está inserida, também controla a interação entre os protômeros da proteína e alterações nas suas propriedades biofísicas podem modular a atividade da enzima. O objetivo do trabalho foi verificar o efeito de diferentes razões detergente/proteína na estabilidade da Na,K-ATPase solubilizada e de diferentes microambientes lipídicos na sua atividade, analisando as alterações no comportamento termotrópico da bicamada com a mudança da composição lipídica, observando as alterações da incorporação e recuperação da atividade enzimática quando a proteína foi reconstituída em sistemas miméticos de membrana. Utilizando o espalhamento dinâmico de luz (DLS) foi possível acompanhar o processo de agregação térmica da enzima, fornecendo informações da sua estrutura, bem como avaliar a sua estabilidade quando solubilizada. A desnaturação térmica da Na,K-ATPase também foi avaliada por calorimetria diferencial de varredura (DSC) e verificou-se que é um processo irreversível, e ocorreu entre 50 e 70°C, sendo a soma de três transições. Utilizando DSC, analisou-se ainda o comportamento termotrópico dos sistemas de lipossomos e proteolipossomos constituídos de DPPC, DPPE e colesterol. Para os sistemas vesiculares, na ausência da proteína, foi observado que para o sistema binário de DPPC e DPPE, o aumento da proporção do último lipídio induz uma separação de fase, assim como a presença de colesterol, tanto nos sistemas binários (DPPC:Col e DPPE:Col), quanto no ternário (DPPC:DPPE:Col). Avaliou-se ainda como o microambiente lipídico interfere na incorporação e atividade da Na,K-ATPase. Verificou que diferentes quantidades de colesterol alteram a atividade enzimática, confirmando que este possui um importante papel na modulação da atividade, alterando propriedades da membrana e influenciando na conformação da proteína. / Na,K-ATPase is an enzyme that is intrinsic to the plasma membrane, responsible for the coupled active transport of Na+ and K+ across animal cell membranes. The enzyme consists of alfa, beta and gama subunits. It has been demonstrated that the alfa-beta form of Na,K-ATPase is capable of both ATP hydrolysis and active ion transport, however accumulating evidence suggest that the enzyme normally self-associates as (alfa-beta)2 dimers. In membrane protein research, the most typical use of a detergent is to maintain a target membrane protein in a functional, folded state in the absence of a membrane. Moreover, it is known that several factors influence the enzymatic activity of Na, K-ATPase and there is evidence that the lipid bilayer, in which the enzyme is located, also controls the interaction between protomers and that changes in their biophysical properties can modulate the activity of the enzyme. The objective of this study was to investigate the effect of different detergent/protein ratios on the stability solubilized of Na, K-ATPase and different lipid microenvironments in their activity by analyzing changes in the thermotropic behavior of the bilayer, analysing the incorporation changes and the recovery of enzyme activity when the protein was reconstituted in a membrane mimetic systems. Dynamic light scattering (DLS) was used to monitor the process of thermal aggregation of the enzyme, providing information on their structure and evaluating its stability when solubized. The thermal denaturation of Na, K-ATPase was also evaluated by differential scanning calorimetry (DSC) and it was verified that it is an irreversible process, which occurred between 50 and 70 ° C, being the sum of three transitions. Using DSC, we analyzed the thermotropic behavior of proteolipossomos and liposomes consisting of DPPC, DPPE and cholesterol. For vesicular systems in the absence of the protein, it was observed that for the binary system of DPPC and DPPE, increasing the proportion of the latter induces a lipid phase separation and the presence of cholesterol in both binary systems (DPPC: Col and DPPE: Chol), and in the ternary system (DPPC: DPPE: Chol) it induces a lipid phase separation. It was also evaluated how the lipid microenvironment interferes on the incorporation and activity of Na, K-ATPase. It was found that different amounts of cholesterol alter the enzyme activity, confirming cholesterol has an important role in the modulation of the activity by altering the membrane properties and influencing the protein conformation.

A organização da membrana biológica em microdomínios tem um papel chave em vários processos celulares semelhante a receptores protéicos e a transdução de sinal. A existência de microdomínios, também denominados de rafts tem sido explicada pela separação das membranas lipídicas em duas fases: liquida cristalina (L) e fase liquida ordenada (Lo) rica em colesterol e esfingolipídeos. Assim, o enfoque deste projeto foi correlacionar mecanismos de controle da atividade da fosfatase alcalina (TNAP) com a organização intermolecular e o estado de fase de alguns lipídios que compõem as vesículas da matrix. Foi estudada a modulação da atividade da enzima e sua inserção à sistemas de lipossomos constituídos com diferentes composições lipídicas (Dipalmitoilfosfatidilcolina, Colesterol, Esfingomielina e Gangliosídeo) como um mecanismo de regulação e transdução entre enzimas que não compartilham intermediários metabólicos comuns. Isto é, verificar como mudanças de organização molecular, induzida por colesterol e/ou outros lipídios, podem modular a atividade de enzimas regulando a produção de mensageiros lipídicos secundários e/ou processos de fusão e recombinação topológica da bicamada lipídica, modulando concomitantemente a atividade da fosfatase alcalina. Com tal propósito, a TNAP foi reconstituída em lipossomos constituídos de DPPC e lipossomos mistos formando sistemas binários DPPC:Chol, DPPC:SM e DPPC:GM1 com razões molares de (9:1); sistemas terciários DPPC:Chol:SM, DPPC:Chol:GM1 e DPPC:SM:GM1 com razões molares de (8:1:1) e por fim sistemas quaternários constituídos de DPPC:Chol:SM:GM1 (7:1:1:1). Estes sistemas foram propostos com o intuito de mimetizarmos os lipid rafts existentes nas membranas biológicas, porém utilizando lipídios que já foram identificados e quantificados nas vesículas da matrix. Foram avaliados os efeitos da composição lipídica dos lipossomos na inserção da enzima aos sistemas vesiculares. Além disso, foram realizados estudos biofísicos de calorimetria analisando como os parâmetros termodinâmicos são afetados com as diferentes composições lipídicas e pela presença da enzima ancorada aos sistemas. A reconstituição da enzima a lipossomos constituídos de DPPC proporcionou uma incorporação em torno de 80% da atividade enzimática. Estudos termodinâmicos dos proteolipossomos formados evidenciaram uma queda significativa nos valores de variação de entalpia em relação aos sistemas de lipossomos (de 7,63 a 1,88 kcal.mol-1). Lipossomos binários constituídos de DPPC:Chol em concentrações crescentes (9:1, 9:2, 9:3, 7:3, 9:4 e 9:5 razão molar) foram estudados tanto pelos parâmetros biofísicos como pela habilidade de inserção da enzima a tais sistemas. Foi observado um significativo decréscimo nos valores de variação entalpia com o aumento da proporção de colesterol no lipossomo. Além disso, a presença do colesterol proporcionou uma redução na inserção da atividade catalítica em até 42%, quando utilizada a composição lipídica de 9:5 DPPC:Chol. Dos sistemas binários formados com razões molares 9:1, o que apresentou maior porcentagem de reconstituição da TNAP foi o sistemas DPPC:Chol, apresentando em torno de 62% de incorporação da enzima. Os sistemas terciários apresentaram ao redor de 30% de incorporação da atividade catalítica e o sistema quaternário em torno de 25%. Além dos ensaios de atividade enzimática, a incorporação da enzima aos sistemas vesiculares também pôde ser comprovada pelas mudanças nos parâmetros termodinâmicas detectados por DSC. Nos estudos de calorimetria de todos os sistemas de proteolipossomos formados, foram observadas significativas diminuições nos valores de variação de entalpia quando comparados aos sistemas de lipossomos correspondentes. Deste modo, os resultados aqui apresentados fornecem novas informações que poderão contribuir tanto para a compreensão do comportamento da atividade da fosfatase alcalina na presença de diferentes composições lipídicas dos microdomínios existente membrana, quanto para o entendimento dos processos de regulação da enzima durante o processo de biomineralização. / The organization of the biological membrane in microdomains has a key roll in many cellular processes similar to proteic receptors and signal transduction. The existence of microdomains, also called rafts, has been explained by the lipid membrane separation in two phases: crystalline phase (L) and ordinate liquid phase (Lo), rich in cholesterol and sphingolipids. The focus of this Project was to correlate activity control mechanisms of the alkaline phosphatase (TNAP) with the intermolecular organization and the phase stat of some lipids that comprise the matrix vesicles. The enzyme activity modulation and its insertion into liposomes systems, constituted by different lipid compositions (DPPC, Chol, SM e GM1) as a regulation and transduction mechanism between enzymes that do not share common intermediary metabolites, was studied. That is, to verify how molecular organization changes, induced by cholesterol and/or other lipids, can modulate the enzyme activity regulating the production of secondary lipid messengers and/or fusion processes and topological recombination of the lipidic bilayer, concomitantly modeling the alkaline phosphatase activity. TNAP was then reconstituted in liposomes constituted by DPPC and mixed liposomes forming binary systems DPPC:Chol , DPPC:SM , DPPC: Chol:GM1 with (9:1) molar rates; tertiary systems DPPC:Chol:SM, DPPC:Chol:GM1 and DPPC:SM:GM1 with (8:1:1) molar rates and finally quaternary system constituted by DPPC:Chol:SM:GM1 (7:1:1:1). These systems were proposed aiming the mimetization of lipid rafts existent in biological membranes, but using lipids that had already been identified and quantified in the matrix vesicles. The effects of liposome lipid composition in the enzyme insertion to the vesicular systems were assayed. Besides that, calorimetry biophysical studies were done analyzing how the thermodynamic parameters are affected by the different lipid compositions e by the presence of the systems anchored enzyme. The enzyme reconstruction to the DPPC constituted liposomes has provided an incorporation of around 80% of the enzyme activity. Thermodynamic studies of the proteoliposomes formed have shown a significant decrease in the H values in relation to the liposomes systems (from 7.63 to 1.88 kcal.mol-1). Binary liposomes constituted of DPPC:Chol in increasing concentrations (9:1, 9:2, 9:3, 7:3, 9:4 e 9:5 molar ratio) were studied by the biophysical parameters as well as by the insertion ability of the enzyme into those systems. A significant decrease in the enthalpy values with the increase of the cholesterol proportion in the liposome was observed. Besides that, the presence of cholesterol has allowed a reduction in the insertion of the catalytic activity in up to 42% when the lipid composition 9:5 DPPPC:Chol was used. Among the binary systems formed with molar ratios of 9:1, the one which showed the highest percentage of TNAP reconstitution was the DPPC:Chol system, with around 62% enzyme incorporation. The tertiary systems had around 30% incorporation of the catalytic activity, and the quaternary system around 25%. Besides the enzymatic activity assays, the enzyme incorporation to the vesicular systems can also be verified by the thermodynamic parameters change detected by DSC. In the calorimetry studies of all the proteoliposomes formed, significant decreases in the enthalpy values were observed when compared to the corresponding liposomes systems. Thereby, the results presented here provide new information that can contribute to understand the alkaline phosphatase behavior in the presence of different microdomain lipid compositions existent in the membrane, as well as understanding the regulation processes of the enzyme during the biomineralization process.

O uso da elevação da temperatura local como recurso adjuvante no combate ao câncer tem sido explorado intensamente nas últimas décadas. A hipertermia, como é chamada essa elevação de temperatura local, apresenta seu maior potencial clínico quando combinada com a quimioterapia e/ou radioterapia, sendo capaz de promover benefícios terap êuticos significativos. Apesar dos resultados positivos, a hipertermia, até o momento, não se estabeleceu como terapia padrão, devido a limitações no controle da deposição de energia e no monitoramento da distribuição de temperatura em tempo real. Neste trabalho, discutem-se características fundamentais da eficiência da hipertermia no tratamento de tumores cerebrais e de bexiga. O projeto foi todo ele desenvolvido em colaboração com o grupo de hipertermia do Department of Radiation Oncology da Duke University. Com relação à hipertermia aplicada ao cérebro, primeiramente apresenta-se o procedimento de desenvolvimento e teste de eficiência de um mini-aplicador de micro-onda dedicado ao aquecimento do cérebro de camundongos. Após estes, avaliou-se a capacidade de disponibilização termo-estimulada da doxorrubicina a modelos tumorais de glioblastoma. O método utilizado para monitoramento da liberação e distribuição da doxorrubicina foi a microscopia confocal de fluorescência intravital. O estudo do impacto da hipertermia sob a distribuição da formulação de doxorrubicina encapsulada em lipossomos termosensíveis demonstrou que a elevação moderada de temperatura promove alterações significativas na permeabilidade da barreira hematoencefálica, além de promover aumento do acúmulo total de droga e aumento no grau de penetração. Para a hipertermia aplicada à bexiga, apresenta-se um estudo de viabilidade de aquecimento para uma metodologia alternativa ao dispositivo de uso clínico padrão (_Synergo_), denominada magneto-hipertermia. Os ensaios com a magneto-hipertermia apontam que o uso de nanopartículas magnéticas sob influência de um campo magnético alternado (40 kHz) é capaz de elevar a temperatura do lúmen da bexiga a 42_C de forma localizada, não promovendo efeitos significativos de aquecimento a tecidos do entorno. / The use of local heating to achieve adjuvant response in cancer treatment has been widely explored in the last decades. The thermal therapy has a well-known clinical bene_t when combined to chemotherapy and/or radiotherapy. Despite all positive results, the use of thermal therapy has not yet been established as standard treatment, mainly due to the limitation on the control of energy deposition and real-time temperature mapping. This thesis discuss some of the fundamentals of the application of hyperthermia to treat bladder and brain tumors. All experiments were performed in collaboration with the Department of Radiation Oncology of Duke University. As regards brain experiments, we developed and built a microwave antenna dedicated to locally heating the mouse brain. After that, we assessed the ability of thermo release and thermo delivery of doxorubicin to glioblastoma tumor models. Intravital confocal fluorescence microscopy was used to monitor the drug release and distribution into brain tissue as a whole. Our findings indicated that a mild elevation in brain temperature (42_C) modulates the permeability of the blood-brain barrier and promotes an increase on both total drug accumulation and drug penetration. Concerning bladder hyperthermia, we investigated the feasibility of magnetic-hyperthermia as an alternative heating source to the standard clinical device (_Synergo_). The magnetic-hyperthermia results indicate that the amount of heat dissipation by the magnetic nanoparticles, under the influence of alternating magnetic field (40KHz), was able to raise the temperature in the bladder lumen to 42_C and did not promote any significant heating effects on surrounding tissues.

A liberação controlada de fármacos é um tópico importante para várias iniciativas em nanotecnologia devido ao possível impacto para a sociedade, com a criação de sistemas otimizados que garantam a liberação num sítio específico e a uma taxa controlada. Dentre os vários paradigmas de liberação controlada destaca-se o uso de lipossomos, uma vez que muitos fármacos e drogas podem ser transportados. Este trabalho descreve a fabricação de filmes automontados de lipossomos que incorporam o fármaco ibuprofeno. Os lipossomos foram preparados de dipalmitoil fosfatidil colina (DPPC), dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG) e palmitoil-oleoil fosfatidil glicerol (POPG), cujas camadas foram alternadas por interações eletrostáticas com camadas do dendrímero PAMAM geração 4. Medidas de espalhamento dinâmico de luz indicaram que a incorporação do ibuprofeno tornou os lipossomos de DPPC e DPPG mais estáveis, com uma diminuição no diâmetro médio de 140 para 74 nm e 132 para 63nm, respectivamente. Ao contrário, os lipossomos de POPG ficaram menos estáveis, com aumento do diâmetro de 110 para 160 nm. A influência na estabilidade foi confirmada em medidas de microscopia de força atômica nos filmes automontados, que mostraram grande tendência à ruptura nos lipossomos de POPG com a incorporação de ibuprofeno. O crescimento dos filmes automontados foi investigado com espectroscopia de fluorescência e uma balança de cristal de quartzo. A intensidade da fluorescência devida ao ibuprofeno aumentou exponencialmente com o número de camadas depositadas, mas não por causa de uma crescente adsorção de ibuprofeno. Ao contrário, a quantidade de material adsorvido nas primeiras camadas aumentou inicialmente, mas depois diminuiu drasticamente após a 6ª. bicamada, e o filme praticamente pára de crescer a partir da 10ª. bicamada. Portanto, a grande fluorescência para filmes espessos deve ser associada a um ambiente favorável, que aumenta a emissão quântica do ibuprofeno. A liberação do ibuprofeno, estudada com medidas de fluorescência, é mais lenta quando incorporado em lipossomos. Em experimentos com uma membrana de diálise, notamos que o tempo de decaimento do ibuprofeno puro é 5,2 h, enquanto este tempo aumentou para 9,2 e 8 h para ibuprofeno encapsulado em lipossomos de DPPG e POPG, respectivamente. O ibuprofeno também foi liberado de filmes automontados contendo lipossomos de DPPG e POPG, o que é promissor para o uso em bandagens (patches). / Controlled drug delivery is a key issue in a number of nanotechnology endeavors owing to the large impact on society that may achieved if improved systems are created which allows for delivery at a specific target and with a controlled rate. Among the various paradigms employed in drug delivery, the use of liposomes is prominent because a variety of drug molecules can be carried. This work describes the fabrication of layer-by-layer (LbL) films made with liposomes incorporating ibuprofen. The liposomes were made with dipalmitoyl phosphatidyl choline (DPPC), dipalmitoyl phosphatidyl glycerol (DPPG) and palmitoyl-oleoyl-phosphatidyl glycerol (POPG), whose layers were alternated with layers of the dendrimer PAMAM generation 4 via electrostatic interactions. According to dynamic light scattering measurements, the incorporation of ibuprofen caused DPPC and DPPG liposomes to become more stable, with a decrease in diameter from 140 to 74 nm and from 132 to 63 nm, respectively. In contrast, liposomes from POPG became less stable, with an increase in size from 110 to 160 nm. These results were confirmed with atomic force microscopy images of LbL films, which showed a large tendency to rupture for POPG liposomes. The film growth was monitored with fluorescence spectroscopy and a quartz crystal microbalance (QCM). The fluorescence intensity arising from ibuprofen increased exponentially with the number of layers, but this was not caused by an increased adsorption of ibuprofen. Instead, the QCM measurements showed that the amount of material adsorbed increases initially with the number of PAMAM/liposome(ibuprofen) layers, but after the 6th bilayer it decreases sharply and film growth practically stops after the 10th layer. Therefore, the inevitable conclusion is that the increased fluorescence is due to a favorable environment for the ibuprofen, whose quantum emission efficiency increases with the number of layers deposited. Also using fluorescence measurements, we noted that release of ibuprofen was delayed when incorporated in liposomes. For instance, in a membrane dialysis experiment, the characteristic decay time was 3.5 h for ibuprofen in solution, whereas this time increased to 9.2 and 8 h for ibuprofen encapsulated into DPPG and POPG liposomes, respectively. Ibuprofen could also be released from the LbL films made with DPPG and POPG liposomes, which is promising for further use in patches.