Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas Recombinantes y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Los dinucleótidos de adenina nicotinamida (NAD(P)(H)) cumplen un rol fundamental como cofactores enzimáticos, principalmente en reacciones de oxido-reducción. Sus concentraciones intracelulares determinan el estado fisiológico celular, en especial la razón NAD(P)H/NAD(P)+, por lo que es necesario tener métodos que permitan una cuantificación confiable de estas moléculas. Los métodos in vitro e in vivo comúnmente utilizados no permiten determinar el estado redox intracelular con precisión dadas las dificultades analíticas que poseen. El diseño de Sensores Fluorescentes Codificados Genéticamente (GEFS, por su sigla en inglés) ayuda a superar esas dificultades, ya que, estos biosensores permiten la cuantificación in vivo y en tiempo real de moléculas específicas, sin dañar las células estudiadas. Estos sensores se diseñan a partir de la fusión de una proteína fluorescente permutada circularmente con un dominio sensor proteico capaz de generar un cambio conformacional en respuesta a la unión de un ligando específico.
Utilizando esta estrategia, muchos GEFS han sido diseñados para la cuantificación in vivo de dinucleótidos. Entre los sensores de dinucleótidos publicados a la fecha de inicio de esta tesis, el sensor Peredox era el único GEFS capaz de detectar la razón NADH/NAD+ intracelular. Peredox utiliza como dominio sensor al represor transcripcional sensible al estado redox T-Rex del organismo Thermus aquaticus. Aunque T-Rex es capaz de unir tanto NADH como NAD+, sólo la unión del dinucleótido reducido induce un cambio conformacional de una forma abierta a una cerrada. Este fenómeno permite a Peredox detectar la razón NADH/NAD+.
Usando Peredox y la información estructural de T-Rex como punto de partida, el objetivo de esta tesis fue estudiar los determinantes estructurales de especificidad de dinucleótido con el fin de avanzar hacia la generación de un GEFS capaz de detectar la razón NADPH/NADP+, del cual no hay sensores diseñados a la fecha. Para esto se utilizaron estrategias de Diseño Racional mediante aproximaciones in silico e in vitro.
Se determinó experimentalmente que el loop β4-β5 de T-Rex contiene determinantes estructurales de la especificidad por dinucleótido. Mediante análisis de Potenciales Estadísticos, comparación de motivos de especificidad basados en homología y simulaciones de Dinámica Molecular, se determinó los residuos clave en la especificidad por NAD(H) y las mutaciones necesarias para obtener una variante NADPH preferente. Se evaluó el efecto de estas mutaciones en la especificidad por NAD(P)H a través de ensayos in vitro de fluorescencia, obteniéndose un sensor preferente por NADPH. Sin embargo, el sensor no presentó un mecanismo de unión mutuamente excluyente a NADPH y NADP+, condición sine qua non para que un sensor de cuenta de la razón NADPH/NADP+ / Nicotinamide adenine dinucleotides (NAD(P)(H)) play a fundamental role as enzymatic cofactors, mostly on oxidation-reduction reactions. The intracellular concentrations of these dinucleotides determine the cellular physiological state, especially the NAD(P)H/NAD(P)+ ratio, so it is necessary to have methods that allow a reliable quantification of these molecules. The in vitro and in vivo methods commonly used do not allow to determine the intracellular redox state with accuracy, given the analytical difficulties they show. The design of Genetically Encoded Fluorescent Sensors (GEFS) aids to overcome these difficulties, since they can perform real-time in vivo detection of specific molecules, without damaging the cells studied. These sensors are designed from the fusion of a circularly permuted fluorescent protein with a protein sensor domain capable of generating a conformational change in response to the binding of a specific ligand.
Using this strategy, many GEFS have been designed for in vivo quantification of dinucleotides. Among the dinucleotide sensors published at the start date of this thesis, the sensor Peredox was the only GEFS capable of detecting intracellular NADH/NAD+ ratio. Peredox uses the redox-sensing transcriptional repressor T-Rex, from Thermus aquaticus, as a sensor domain. Although T-Rex is capable of binding both NADH and NAD+, only the binding of the reduced dinucleotide induces a conformational change from an open to a closed form. This phenomenon allows Peredox to detect the NADH/NAD+ ratio.
Using Peredox and the structural information of T-Rex as a starting point, the goal of this thesis was the study of the structural determinants of dinucleotide specificity, with aim to achieve to a GEFS capable of detecting the NADPH/NADP+ ratio. There is no sensor designed for this parameter to date. To achieve this goal, we used Rational Design strategies, through in silico and in vivo aproximations.
We determined experimentally that β4-β5 loop of T-Rex contains structural determinants of dinucleotide specificity. Through statistical potential analysis, homology-guided comparison of specificity motifs and Molecular Dynamics simulations, a triple mutant of T-Rex was proposed. The effect of these mutations on the specificity for NAD(P)H was evaluated through in vitro fluorescence assays, obtaining a Peredox variant with NADPH preference. However, the sensor did not show a mutually-exclusive binding fashion of NADPH and NADP+, a sine qua non condition for a sensor of the NADPH/NADP+ ratio / Fondecyt
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/151357 |
| Date | January 2018 |
| Creators | Cid Hidalgo, Dixon Andrés |
| Contributors | Cabrera Paucar, Ricardo |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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