Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / En el origen de la nefropatía diabética (ND) intervienen factores genéticos. La
proteína nefrina es esencial para la constitución de la barrera de filtración glomerular, y
cuando está alterada en su excreción es indicador de compromiso renal. Esta proteína
está codificada en el gen NPHS1 ubicado en el cromosoma 19 humano. En este gen
están descritos 82 SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) en su gen, 8 de los
cuales se encuentran en zonas codificantes y sólo 3 de éstos son no sinónimos
(E117K, K447E y N1077S).
El objetivo principal de esta tesis es identificar SNPs del gen de nefrina en
diabéticos chilenos tipo 1 (DM1) y tipo 2 (DM2) y relacionarlos con ND. Otro objetivo
es pesquisar la presencia de nefrinuria y relacionarla con la presencia de SNPs en el
gen de nefrina.
Para realizar estos análisis seleccionamos al azar 67 pacientes DM1, 94
pacientes DM2 (distribuidos: 32 y 36 normoalbuminúricos, 22 y 36 microalbuminúricos,
13 y 28 macroalbuminúricos, respectivamente), 22 nefrópatas no diabéticos y 36
individuos sanos. A estos pacientes se les extrajo ADN de sangre periférica, se
amplificaron 2 segmentos específicos del gen de nefrina mediante PCR (Polymerase
Chain Reaction), los cuales contenían 2 de los 3 polimorfismos no sinónimos descritos
para este gen (E117K y N1077S). Los amplificados se analizaron mediante SSCPPCR
(Single-Strand Conformational Polymorphism) y se secuenciaron. También se
tomaron muestras de orina de todos los individuos incorporados al estudio, las cuales fueron analizadas con anticuerpos anti-nefrina, para pesquisar la presencia de
nefrinuria.
Mediante SSCP-PCR se encontraron diferencias en la migración electroforética
que sugirieron la presencia de polimorfismos para uno de los segmentos analizados,
que contenía el polimorfismo SNP rs#4806213 (N1077S). Se detectó la presencia de
una variante electroforética en el 26,8% de los pacientes DM1, 19,1% de los DM2, 18,2
% de los nefrópatas no diabéticos y 5,6% controles sanos (p<0,05 DM vs controles
sanos y diferencias no significativas en DM1 y DM2, normo-, micro- o
macroalbuminúricos). Mediante la secuenciación del ADN se detectó que en el 95% de
los casos, la variación detectada corresponde al SNP rs#466452 ubicado en el intrón
24, que también se encuentra en la región amplificada por PCR, y sólo el 5%
correspondía al SNP rs#4806213 (exón 24). En el análisis de nefrinuria no se logró
detectar nefrina por medio de tres anticuerpos anti-nefrina distintos en los diversos
grupos de pacientes.
En conclusión, la técnica SSCP-PCR es sensible, confiable y de bajo costo, es
un buen método de barrido o screening para detectar SNPs, aunque es importante
ajustar en forma especifica electroforéticas en cada caso y verificar los polimorfismos
mediante secuenciación. Los SNPs rs#3814995 y rs#4806213 del gen de nefrina se
encuentran presentes en la población chilena, pero no tendrían asociación con
diabetes ni ND. El SNP rs#466452 es más frecuente en diabéticos y la presencia de
este polimorfismo intrónico determina la aparición de una secuencia tipo ESE (Exon
Splicing Enhancer), cuya funcionalidad debe ser corroborada por medio de RT-PCR / Genetic factors are involved in the development of diabetic nephropathy (DN). Nephrin
protein is essential of the glomerular filtration slit, and is an indicator of renal damage.
Human nephrin is encoded by the NPHS1 gene located on chromosome 19. 82 SNPs
(Single Nucleotide Polymorphisms) have been described in its gene, 8 of which are
found in coding zones and only 3 of these are non-synonymous (E117K, K447E and
N1077S).
The main subject of this thesis is to identify nephrin non-synonymous SNPs in Chilean
diabetic type 1 (DM1) and type 2 (DM2) patients and its relationship with DN. Another
aim is to detect nephrinuria and relate it to the presence/frequency of these SNPs in
the nephrin gene.
In order to carry out these analysis, 67 DM1 patients, 94 DM2 patients (32 and 36
normoalbuminurics, 22 and 36 microalbuminurics, 13 and 28 macroalbuminurics,
respectively), 22 non-diabetic nephropaths and 36 healthy individuals were selected.
DNA was extracted from peripheral blood to amplify 2 specific segments of the nephrin
gene by PCR (Polymerase Chain Reaction) which contained 2 of the 3 described nonsynonymous
polymorphisms for this gene (E117K and N1077S). The PCR-fragments
were analyzed by SSCP-PCR (Single-Strand Conformational Polymorphism-PCR) and sequenced. Also urine samples were taken from all individuals incorporated into the
study and analyzed using polyclonal anti-nephrin antibodies to study the presence of
nephrinuria.
In the segment that contained SNP rs#4806213 (N1077S) polymorphism analyzed by
SSCP-PCR, differences in electrophoretical migration were found, suggesting the
presence of a polymorphism. This difference was found in 26.8% of DM1 patients,
19.1% of DM2, 18.2% in non-diabetic nephropaths and 5.6% in healthy controls
(p<0.05 DM1 vs healthy individuals, differences were not significant between DM1 and
DM2, normo-, micro- or macroalbuminurics). When the SSCP-PCR samples positive for
a variation in electrophoretic migration were sequenced to verify results, two SNPs
were detected: in 95% of the cases the detected variation corresponded to SNP
rs#466452 located in intron 24, also found in the PCR amplified region, and only 5%
corresponded to SNP rs#4806213 in exon 24. The use of three different antibodies in
nephrinuria analyses was not able to detect nephrin, in the different group of patients.
SSCP-PCR is a sensitive and reliable technique, and it is a good method for screening
and detecting SNPs; however it is important to verify results by direct sequencing.
SNP´s rs#3814995 and rs#4806213 are present in the Chilean population, but may
have no association with diabetes or DN. SNP rs#466452 is more frequent in DM1
patients and the presence of this intronic polymorphism determines the appearance of
an ESE site (Exon Splicing Enhancers), but the existence of a functional ESE site must
be corroborated by RT-PCR
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/105546 |
| Date | January 2006 |
| Creators | González Morecchio, Rodrigo Andrés |
| Contributors | Lobos Camus, Sergio, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular |
| Publisher | Universidad de Chile, Programa Cybertesis |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | González Morecchio, Rodrigo Andrés |
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