Neospora caninum is a tissue-cyst forming parasite that belongs to the phylum Apicomplexa. Dogs and other canids are the definitive hosts of N. caninum and they are responsible to excrete oocysts, the environmentally resistant stage of the parasite. Viable parasites have been isolated from a variety of species, especially herbivorous, confirming their role as intermediate hosts. The importance of birds in the life cycle of N. caninum is not clear. Several experiments, using tachyzoites as inoculum, were conducted in domestic and wild birds and the results were not conclusive. In nature, the possible mode of transmission in chickens is the ingestion of oocysts. This work aimed to evaluate the infection by N. caninum in chickens orally inoculated with oocysts obtained from a new isolate of N. caninum. For that, approximately 400 g of brain from a naturally infected adult cattle, showing anti-N. caninum antibodies by means of the immunfluorescent antibody test - IFAT (titre = 200), were fed to a 2-month-old dog. Neospora-like oocysts were observed on day 7 post-inoculation (p.i.). The DNA obtained from oocysts was molecularly characterized using the ITS-1 marker and the final sequence was 99% identical to homologous sequences of N. caninum. Gerbils (Meriones unguiculatus) were orally inoculated with different doses of oocysts (10, 100 and 1000 oocysts), and all of them remained clinically normal and developed N. caninum antibodies 14 days p.i. (titre ≥ 50 by IFAT). Brain homogenate from an infected gerbil was seeded into a monolayer of Vero cells and tachyzoites were visualized at 24 days p.i.. Microsatellite genotyping using DNA from the tachyzoites revealed a unique genetic profile for this new reference isolate, named NC-SP1. Thirty White Leghorn chickens (Gallus gallus domesticus) were orally inoculated with viable N. caninum oocysts from the NC-SP1 isolate (200 oocysts per bird) via the crop at 21 days of age. Groups of three birds were euthanized at intervals of 7 days during 9 weeks; one group was challenged with the same oocysts dose at 37 days p.i. and observed for 11 weeks. Blood samples were collected weekly, and sera were tested by IFAT. Chicken tissues were analyzed using PCR, quantitative PCR and immunohistochemistry (IHC). Two mongrel dogs, approximately 45 days of age were fed with tissues from chickens euthanized at 138 and 159 days p.i.. The chickens did not seroconvert (titre < 5), and neither DNA (PCR and qPCR) nor antigen (IHC) of N. caninum was detected in inoculated chicken tissues. In addition, no oocyst excretion by the dogs was observed. In these experimental conditions, the chickens were resistant to N. caninum infection. / Neospora caninum é um parasita formador de cistos teciduais que pertence ao filo Apicomplexa. O cão doméstico e outros canídeos são os hospedeiros definitivos de N. caninum, pois podem excretar nas fezes os oocistos, o estágio ambientalmente resistente do parasita. Parasitas viáveis foram isolados de diversas espécies, principalmente herbívoros, confirmando seu papel como hospedeiros intermediários. A importância das aves no ciclo biológico de N. caninum ainda não está bem definida. Vários experimentos, utilizando taquizoítas como inóculo, foram realizados em aves domésticas e silvestres e os resultados não foram conclusivos. Na natureza, a via de transmissão mais provável para as galinhas é a ingestão de oocistos. Este trabalho teve como objetivo avaliar a infecção por N. caninum em galináceos infectados por via oral com oocistos de um novo isolado de referência de N. caninum. Inicialmente, 400g de cérebro de um bovino adulto naturalmente infectado, apresentando anticorpos anti-N. caninum por meio da reação de imunofluorescência indireta - RIFI (título = 200), foram oferecidos para um cão de 2 meses de idade. Oocistos Neospora-like foram visualizados 7 dias pós inoculação (p.i.). A sequência final obtida a partir do DNA extraído dos oocistos, baseada no marcador ITS-1, teve 99% de similaridade com sequências homólogas de N. caninum. Gerbilos (Meriones unguiculatus) foram inoculados com diferentes doses de oocistos (10, 100 e 1000 oocistos) por via oral, e todos eles permaneceram clinicamente normais e anticorpos contra N. caninum foram detectados 14 dias p.i. por meio da RIFI (título ≥ 50). O homogenado do cérebro de um gerbilo infectado foi inoculado em uma monocamada de células da linhagem celular Vero e taquizoítas foram observados no cultivo celular 24 dias p.i.. A genotipagem por microssatélites do DNA extraído desses taquizoítas revelou um perfil genético único ao novo isolado de referência, designado NC-SP1. Trinta galináceos (Gallus gallus domesticus) da linhagem White Leghorn foram então inoculados via papo aos 21 dias de idade com oocistos de NC-SP1 (200 oocistos por ave). As eutanásias foram realizadas em intervalos de 7 dias para cada grupo de três aves, durante 9 semanas, e um grupo foi desafiado com a mesma dose de oocistos aos 37 dias p.i. e acompanhado por 11 semanas. Amostras de sangue foram colhidas semanalmente, e os soros testados por meio da RIFI. Os tecidos das aves foram analisados por meio da PCR, PCR quantitativa (qPCR) e imunohistoquímica (IHQ). Dois grupos de aves foram eutanasiados aos 138 e 159 dias p.i. e os tecidos foram oferecidos para dois cães sem raça definida com aproximadamente 45 dias de idade. Os galináceos não soroconverteram (título < 5), e o DNA (PCR e qPCR) e o antígeno (IHQ) de N. caninum não foram detectados nos tecidos das aves. Oocistos de N. caninum não foram excretados pelos cães. Nestas condições experimentais, os galináceos foram resistentes à infecção por N. caninum.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-17042018-145122 |
| Date | 15 December 2017 |
| Creators | Oliveira, Solange de |
| Contributors | Pena, Hilda Fátima de Jesus |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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