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Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas é uma doença negligenciada causada pelo protozoário parasita Trypanosoma cruzi, o qual afeta cerca de 6-8 milhões de pessoas em áreas endêmicas da América Latina. As diferentes cepas envolvidas na infecção, e sua distribuição regional, tem sido sugeridas como causa das diferentes manifestações clínicas, resposta ao diagnóstico e eficácia terapêutica. A ecto-NTPDase é uma enzima localizada na superfície externa da membrana plasmática do T.cruzi, que hidrolisa nucleotídeos tri e difosfatados. Estudos anteriores têm relacionado esta enzima à infectividade e virulência de tripanosomatídeos, além de sugerir um papel importante na captação de purinas pelos parasitos. Neste trabalho avaliamos os níveis de mRNA para a TcNTPDase-1 por RT-PCR, em diferentes isolados do parasito (Dm28c- T.cruzi I; Y- T.cruzi II; 3663- T.cruzi III; 4167- T.cruzi IV; LL014- T.cruzi V; CL-14- T.cruzi VI- avirulenta), em formas não-infectantes (epimastigotas) e infectantes (tripomastigotas e amastigotas). Os ensaios de PCR em Tempo Real foram realizados com oligonucleotídeos desenhados para amplificar uma sequência de 111pb do gene TcNTPDase-1 e, como controles endógenos, uma sequência de 268pb do gene da TcCalmodulina e uma sequência de 100pb do gene TcGAPDH foram utilizados. Nós observamos que epimastigotas das cepas Y, 3663, 4167 e LL014 apresentaram os mesmos níveis de expressão do gene TcNTPDase-1 que o clone CL-14, avirulento
Por outro lado, o clone Dm28c expressou 7,2\F0B11,5 vezes mais o gene desta enzima que o clone CL-14. Além disso, observamos que as formas infectantes tripomastigota e amastigota apresentaram, respectivamente, uma expressão 22,5\F0B15,6 e 16,3\F0B13,8 vezes maior que a forma epimastigota. Observamos também que durante a curva de crescimento de formas epimastigotas a 28°C e 37°C a expressão deste gene aumenta gradativamente com o tempo de cultivo, sendo mais pronunciado a 37°C, sugerindo que o choque-térmico e o longo período de cultivo pode aumentar a expressão do gene da TcNTPDase-1. Em conjunto, nossos dados sugerem que a TcNTPDase-1 estaria envolvida nos processos de infectividade do T.cruzi, bem como adaptação do parasita a temperatura do hospedeiro vertebrado. Devido sua importância para o T.cruzi, a TcNTPDase-1 apresenta potencial para ser avaliada como possível alvo para quimioterapia da Doença de Chagas / Chagas disease is a negl
ected illness caused by the parasite protozoan
Trypanosoma cruzi
, which affects
6
-
8 million people in endemic areas of Latin
America
.
The distinct
strains involved in infection, in conjunction with the regional
distribution, have been suggested to cause di
fferent clinical manifestations and
therapeutic efficiency in Chagas Disease. The ecto
-
NTPDase is an apyrase located
on the outer surface of
T.
cruzi
plasma membrane
-
that
hydrolyzes
tri
-
and/or di
-
phosphate nucleotides
. Previous studies related this enzyme
to the infectivity and
virulence of the parasite
, and suggest an important role in the uptake of purines
. In
this study, we evaluate the mRNA levels for the
e
cto
-
NTPDase I by
RT
-
PCR
in
distinct
isolated parasites
(Dm28c
-
T.
cruzi
I; Y
-
T.
cruzi
II; 3663
-
T.
cruzi
III; 4167
-
T.
cruzi
IV; LL014
-
T.cruzi
V
; CL
-
14
-
T.
cruzi
VI
-
avirulent
)
, in non
-
infective forms
(epimastigotes) and infective forms (amastigotes and trypomastigotes)
.
The
Real
Time PCR assays were performed with primers designed to amplify a 111b
p
seq
uence in the TcNTPDase
-
1
gene and,
as endogenous controls, a 268bp
sequence in the TcCalmoduline
gene and a 100bp sequence in the
Tc
GAPDH gene
were used. We observed that the
epimastigotes of
strain
s Y,
3663, 4167 e
LL014
expressed
the same
levels
of the g
ene of TcNTPDase
-
1
that the CL
-
14 clone,
avirulent. On the other hand, the Dm28c clone expressed
7
.
2
1
.
5 times higher the
gene of this enzyme that the C
L
-
14 clone.
Surprisingly, w
e observed that the
trypomastigote
and amastigote presented expression levels
, respectively,
22
.
5
5
.
6
and 16
.
3
3
.
8
time
s higher than the epimastigote
form. Moreover, following the
epimastigotes
growth curve
at
28°C e 37°C
, we also observed that
the expression of
TcNTPDase
-
1
increases with the days of growth, and this increase is mo
re
pronounced at
37°C
,
suggesting that heat
shock and long
-
term cultivation could
increase TcNTPDase
-
1 gene expression
.
In conjunction, our results suggest the role
of TcNTPDase
-
1 on
T.
cruzi
infectivity and adjustment to stress conditions s
uch as
nutrients
starvation and
heat shock. Due to its importance for
T.
cruzi
, TcNTPD
ase
-
1
has the potential to be
e
valuated as a possible target for chemotherapy of
Chagas
Disease
.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/13489 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Gomes, Natália Lins da Silva |
| Contributors | Garzoni, Luciana Lopes de Almeida Ribeiro, Bello, Alexandre Ribeiro, Ferreira, Marcelo Alves, Meis, Juliana de, Escobar, Patrícia Cuervo, Moreira, Otacílio da Cruz |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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