L’élément L1 (Long Interspersed Nuclear Element 1 ou L1) est le seul rétrotransposon autonome et actif connu dans notre génome, représentant 17% de celui-ci. Capable de se répliquer grâce à un intermédiaire à ARN et un mécanisme de transcription inverse initiée au site d’intégration, il encode deux protéines ORF1p et ORF2p, qui s’associent à l’ARN L1 pour former une particule ribonucléoprotéique (RNP). L’élément L1 rétrotranspose préférentiellement en cis : un L1 défectif est complémenté en trans par un élément fonctionnel de façon inefficace. Ce travail s'intéresse à deux étapes clefs du cycle réplicatif du L1 : l'assemblage de la RNP L1 en cis ou en trans afin d’explorer le mécanisme de la cis-préférence et la spécificité de l’initiation de la reverse transcription initiée. Nous avons d’abord comparé deux méthodes d’analyse de l’activité RT. Puis, nous avons montré l’importance de la complémentarité entre queue poly(A) de l’ARN L1 et site d’intégration durant l’initiation de la RT, ainsi que l’impact de mésappariements terminaux éventuels. Enfin, nous avons étudié les bases biochimiques de la cis-préférence, à travers la coexpression et la purification de deux éléments distincts étiquetés, ce qui nous a permis de suivre l'assemblage et l'activité de leurs RNPs respectives. Nos données suggèrent que ORF1p et ORF2p peuvent lier en trans l’ARN L1 de façon efficace et que la cis-préférence pourrait nécessiter des quantités limitantes de L1. / The Long Interspersed Nuclear Element 1 (LINE-1 ou L1) is the only known active and autonomous retrotransposon in the human genome and constitutes around 17% of our genomic DNA. The L1 element is able to replicate through an RNA intermediate by a mechanism called target-primed reverse transcription and encodes two proteins ORF1p and ORF2p, which associate with the L1 RNA to form a ribonucleoprotein particle (RNP). L1 preferentially retrotranspose in cis: a defective L1 can only be rescued in trans at low levels by a replication-competent copy. During this work, we focused on two essential steps of the L1 replication cycle: the assembly of the L1 RNP in cis or in trans to explore the mechanism of the cis-preference and the specificity of L1 reverse transcription priming. First, we compared two different methods to detect L1 RT activity. Then, we showed the importance of base-pairing between the poly(A) tail of the L1 RNA and the integration site to prime reverse transcription and the impact of potential mismatches. Finally, we investigated the biochemical basis of the cis-preference through the coexpression and purification of two different tagged L1 elements, which allowed us to follow the assembly and activity of their RNP. Our data suggest that binding of ORF1p and ORF2p in trans is efficient and that the cis-preference might requires limiting L1 levels.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2014NICE4133 |
| Date | 19 December 2014 |
| Creators | Viollet, Sébastien |
| Contributors | Nice, Cristofari, Gaël |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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