L'objectif de mon travail de doctorat consistait à explorer l'expression génique du cumulus au regard de la compétence au développement de l'ovocyte bovin. Cette exploration tire son intérêt des nombreuses démonstrations du rôle crucial du cumulus auprès de l'ovocyte mammalien. En premier lieu, nous avons appliqué à des vaches de race laitière, un protocole de stimulation ovarienne permettant la modulation de la compétence ovocytaire, en agissant sur la différenciation folliculaire, via l'hormone folliculo-stimulante (FSH). Trois variantes de la compétence développementale de l'ovocyte ont ainsi pu être obtenues : acquisition de compétence en cours, compétence acquise et déclin de compétence. En dépit des différences modérées de compétence engendrées, le transcriptome des cellules du cumulus les reflète quand même. Ces variations bien que minimes, de l'expression génique du cumulus, appuient l'idée générale que la compétence ovocytaire serait le résultat non seulement de changements substantiels par l'environnement, mais aussi d'une régulation beaucoup plus fine des mécanismes folliculaires.Suite aux résultats de la première étude, nous avons voulu obtenir un portrait transcriptomique du cumulus plus contrasté. Pour ce faire, des biopsies de cumulus ont été réalisées sur des complexes ovocyte-cumulus (COC) d'abattoir suivis individuellement, de leur maturation à leur développement in vitro, et catégorisés selon que le développement ce soit arrêté à 2-8 cellules – i.e. avant l'activation du génome embryonnaire – ou qu'il se soit poursuivi jusqu'au stade de blastocyste. De cette manière, les cumuli associés à la formation d'un blastocyste, et donc à des ovocytes compétents, montrent une expression génique clairement différente de ceux dont le développement embryonnaire a échoué. Ces différences concernent des fonctions telles que : la modification post-traductionnelle, le repli des protéines, le métabolisme des acides aminés, la dégradation des protéines ou encore l'épuration des radicaux libres qui se trouvent surexprimées dans les cumuli compétents. Dans un troisième temps, c'est l'implication de l'hormone lutéinisante (LH) dans l'expression génique du cumulus qui a été évaluée. Le même protocole que celui de la première étude a été appliqué, en rajoutant cette fois des injections de Cétrorelix afin de supprimer la sécrétion de LH en fin de croissance folliculaire – i.e. lors de l'acquisition de la compétence au développement. Bien que l'absence de LH n'ait pas eu d'impact significatif sur la compétence ovocytaire, le transcriptome du cumulus a lui été significativement affecté. Ainsi, l'expression de fonctions comme la survie, la prolifération ou la croissance du follicule est inhibée par l'absence de LH. Par ailleurs, des fonctions de maintenance cellulaire telles que la transcription, le métabolisme des acides aminés et des protéines, ainsi que la production d'énergie semblent également pâtir de cette absence. Le soutien de la LH serait donc important pour les fonctions du cumulus lors de la maturation finale du follicule. Finalement, la présence du récepteur à la LH (R-LH) dans le cumulus bovin étant controversée dans la littérature, nous avons cherché à suivre l'expression génique de ce R-LH dans les cellules de COC en cours de maturation in vitro. Nous avons également examiné l'expression de la mévalonate kinase (MVK), dont le transcrit est reconnu en tant que régulateur de l'expression du R-LH ; et aussi surveillé l'expression de différentes enzymes stéroïdogènes ainsi que celle du récepteur à la progestérone (PGR). Le suivi d'expression génique a été réalisé à intervalles de trois heures, de 0 à 24 h de maturation, et n'a pour autant pas permis de détecter la présence de transcrits du R-LH dans le cumulus, tandis que l'expression génique de la MVK augmente au cours de la maturation. Les transcrits des enzymes stéroïdogènes STAR et HSD3β, bien que faiblement exprimés, ont été retrouvés ; et l'expression de CYP11A1 et PGR quant à elle augmente pendant la maturation. Ainsi, d'une part, la supplémentation en LH des milieux de maturation ne semble pas pertinente chez le bovin ; d'autre part, le cumulus pourrait être capable d'utiliser le cholestérol pour la stéroïdogenèse et de répondre à une stimulation par la progestérone puisqu'il en exprime le récepteur. Ces travaux participent ainsi à accroître la connaissance du transcriptome spécifique au cumulus bovin et son lien avec la compétence ovocytaire au développement. Enfin, les données acquises ici offrent de nouvelles pistes à explorer afin d'améliorer la qualité ovocytaire, tant in vitro qu'in vivo. / In this thesis report, the cumulus cell gene expression regarding oocyte developmental competence was explored in bovine. This interest is based on the proven crucial role in the differentiation of the cumulus to the mammalian oocyte. First, we applied an ovarian stimulation protocol to dairy cows which allows modulation of oocyte competence using FSH to influence follicular differentiation. Then, three oocyte competency states were obtained: increasing competence, competence acquired and decreasing competence. In spite of moderated competency fluctuations, cumulus cell transcriptome still reflects them. The small variations in cumulus gene expression reinforce the general idea that oocyte competence is the result not only of substantial changes due to the environment, but also of a much finer regulation of follicular mechanisms. Following the results of the first study, we wanted to obtain a more contrasted transcriptomic picture of the cumulus. To do so, cumulus biopsies were performed on slaughterhouse cumulus-oocyte complexes (COC) monitored individually, from their maturation to their in vitro development, and categorized according to whether the development was stopped at 2-8 cells – i.e. the embryonic genome activation – or continued until the blastocyst stage. In this way, the cumuli associated with a blastocyst formation, and therefore with competent oocytes, show a clearly different gene expression from those whose embryonic development has failed. These differences concern functions such as: posttranslational modification, protein folding, amino acid metabolism, protein degradation or free radical scavenging that are over-expressed in competent cumuli. Thirdly, we evaluated the involvement of luteinizing hormone (LH) in cumulus gene expression. The same protocol as that of the first study was applied, with the addition of Cetrorelix injections in order to suppress the LH secretion at the end of follicular growth – i.e. during developmental competence acquisition. Although the absence of LH did not impacted significantly on oocyte competence, the cumulus cell transcriptome was significantly affected. Thus, the expression of functions such as survival, proliferation or follicular growth is inhibited in the absence of LH. In addition, cell maintenance functions such as transcription, amino acid and protein metabolism, and energy production also seem to suffer from this absence. LH support would therefore be important for cumulus functions during the final maturation of the follicle. Finally, because of the controversy found in literature concerning the presence of the LH receptor (LH-R) in bovine cumulus, we sought to follow the gene expression of this LH-R in in vitro maturing COC cells. Also, we examined the expression of mevalonate kinase (MVK), whose transcript is recognized as a regulator of R-LH expression; and monitored the expression of various steroidogenic enzymes as well as that of the progesterone receptor (PGR). Gene expression observation was performed every 3 hours, from 0 to 24 h of maturation, and did not allow the detection of any R-LH transcripts in the cumulus, while MVK gene expression increases during maturation. The transcripts of the STAR and HSD3β steroidogenic enzymes were found, although weakly expressed; and the expression of CYP11A1 and PGR increases during maturation. Thus, on the one hand, LH supplementation of maturation media does not seem relevant in cattle; on the other hand, cumulus may be able to use cholesterol for steroidogenesis and to respond to a progesterone stimulation since it expresses its receptor. This work thus contributes to increase knowledge of the bovine cumulus transcriptome and its link with oocyte developmental competence. Finally, the data acquired here offer new avenues to explore in order to improve oocyte quality, both in vitro and in vivo.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/31529 |
| Date | 04 October 2018 |
| Creators | Bunel, Audrey |
| Contributors | Richard, François J., Sirard, Marc-André |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | thèse de doctorat, COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xix, 139 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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