Cotutelle - Mélanie Dieudé / L’ischémie-reperfusion inhérente à toute transplantation d’organe solide induit l’apoptose des
cellules endothéliales. Les cellules endothéliales apoptotiques sécrètent des vésicules
extracellulaires apoptotiques de type exosome (ApoExo). L’internalisation des ApoExo par les
cellules endothéliales (CE) adjacentes conduit à des changements fonctionnels importants dont
le dysfonctionnement endothélial. Cependant, les mécanismes d’internalisation des ApoExo par
les CE sont méconnus. Des marqueurs fluorescents spécifiques aux protéines et à l’ARN ont été
utilisés afin de marquer spécifiquement les ApoExo et étudier leur internalisation par microscopie
confocale et cytométrie de flux. Les ApoExo ont été internalisés par les CE en fonction du temps
et de la concentration. L’inhibition des voies classiques d’endocytose à l’aide d’inhibiteurs
pharmacologiques et d’interférence par ARN n’a pas réduit les niveaux d’internalisation des
ApoExo. Le blocage de la phosphatidylsérine des ApoExo avec l’annexine-V a réduit leur
internalisation. L’analyse ultrastructurelle par microscopie électronique des CE a révélé la
présence de structures lamellipodes importantes pour la macropinocytose dont l’inhibition a
diminué le transfert d’ARN et de protéines dans les CE. L’analyse par RT-qPCR a révélé que l’ARNm
PCSK5, le plus enrichi dans les ApoExo, est augmenté dans les CE traitées aux ApoExo. Cette
augmentation est abolie avec ApoExo exempts d’ARNm PCSK5. Ces résultats démontrent que les
ApoExo sont activement internalisés par macropinocytose dépendante de la phosphatidylsérine,
favorisant leur internalisation en augmentant l’activité macropinocytique des CE. Les ApoExo
transfèrent ainsi des ARN fonctionnels capables de moduler le protéome des CE. Ces résultats
ouvrent de nouvelles portes pour la prévention de l’internalisation des ApoExo, et donc de la
dysfonction endothéliale. / Ischemia-reperfusion injury inherent to solid organ transplantation induces endothelial
apoptosis, releasing apoptotic exosome-like vesicles (ApoExo) which in turn induce endothelial
dysfunction. We showed that ApoExo modulates gene expression, functions, and morphology of
endothelial cells (EC) towards endothelial dysfunction. However, the mechanism by which EC
internalize ApoExo remains unclear. Fluorescent probes specifically targeting proteins and RNA
were used to track ApoExo uptake in EC by flow cytometry and confocal microscopy.
Pharmacological inhibitors and gene silencing were used to probe uptake mechanisms. RNA and
protein expression were quantified using Taqman RT-qPCR and immunoblot, respectively. Uptake
of ApoExo by EC was observed in a time- and concentration-dependent manner. Inhibition of
clathrin- and caveolae-dependent endocytosis did not decrease ApoExo internalization by EC.
Blocking phosphatidylserine on ApoExo surface with annexin-V decreased ApoExo uptake.
Ultrastructural analysis of serum-starved EC via electron microscopy revealed lamellipodia-like
structures, hallmark of macropinocytosis, whose number increased following ApoExo exposure.
Inhibition of macropinocytosis abrogated both RNA and protein transfers from ApoExo to EC. The
most enriched mRNA in ApoExo, coding for PCSK5, showed enhanced levels in ApoExo-treated EC
along with increased PCSK5 protein levels. This was abrogated by both macropinocytosis
inhibition and depletion of PCSK5 mRNA in ApoExo. These results demonstrate that EC actively
internalize ApoExo through phosphatidylserine-dependent macropinocytosis, and moreover, that
ApoExo further increase macropinocytosis. These findings also show that functional RNAs can be
delivered to EC through ApoExo. These results open new avenues for preventing ApoExo
internalization and counteracting the development of endothelial dysfunction.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/28520 |
| Date | 11 1900 |
| Creators | Brodeur, Alexandre |
| Contributors | Hébert, Marie-Josée, Dieudé, Mélanie |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | fra |
| Detected Language | French |
| Type | thesis, thèse |
| Format | application/pdf |
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