Das Hamsterpolyomavirus (HaPV) wurde aus Hauttumoren von HaPV-infizierten Hamstern isoliert und gereinigt. Die Virionen sind ca. 45 nm groß und sind durch einen Polyomavirus-typischen ikosaedrischen Aufbau gekennzeichnet. Im Gegensatz zu den Kapsiden anderer Polyomaviren zeigen sie jedoch eine T=7-laevo Symmetrie. Die Analyse der Proteinzusammensetzung zeigte, daß das HaPV-Kapsid hauptsächlich aus drei Virus-kodierten Strukturproteinen (VP1, VP2 und VP3) besteht. Das VP1 repräsentiert ca. 71% des Gesamtkapsidproteins und stellt somit das Hauptkapsidprotein dar. Die Vorher-sage des VP1-ORF ergab 2 in-frame befindliche potentielle Translationsinitiationssignale (ATG), die zur Synthese von VP1-abgeleiteten Proteinen von 384 und 388 Aminosäuren füh-ren sollten. Die Sequenzierung des N-Terminus des viralen VP1 ergab, daß die Translations-initiation am 2. ATG des VP1-ORF erfolgt, so daß das authentische VP1 384 Aminosäuren beinhaltet (MG: ca. 41,8 kDa). Das authentische und das N-terminal verlängerte VP1 wurden in Insektenzellen zur Expres-sion gebracht. Die Proteine reagierten im Western blot mit HaPV-VP1-spezifischen Kanin-chenseren und Seren von HaPV-infizierten Hamstern. Beide VP1-Derivate sind in der Lage, in Insektenzellen Virus-ähnliche Partikel zu bilden. Diese Partikel ähneln in ihrer Dichte und Struktur leeren HaPV-Virionen. Durch elektronenmikroskopische Untersuchungen und Zell-fraktionierung konnte die nukleare Lokalisation der Partikel in Insektenzellen gezeigt werden. Durch Behandlung der Partikel mit EGTA/DTT lassen sich die Partikel in Pentamere dissozi-ieren. Möglicherweise können die Partikel durch Dissoziation und anschließende Reassozia-tion mit fremder Nukleinsäure beladen werden, um für gentherapeutische Anwendungen ein-gesetzt zu werden. Zur Ermittlung potentieller Insertionsorte für Fremdsequenzen im VP1 wurde die dreidimen-sionale Struktur des HaPV-VP1 auf der Basis verwandter Polyomaviren vorhergesagt und eine Epitopkartierung mit Hilfe in E. coli exprimierter rekombinanter VP1-Derivate und syn-thetischer Peptide durchgeführt. Die Vorhersage der Struktur ergab 5 oberflächenexponierte Regionen: As 81-88, As 222/223, As 244-246, As 289-294 und die C-terminale Region von VP1. Zwei der genannten Regionen (As 79-97 und die C-terminale Region von VP1) konnten bei beiden Epitopkartierungsstudien als Epitope identifiziert werden. Wahrscheinlich sind in der C-terminalen Region (As 320-384) sowohl lineare als auch mindestens ein diskontinuier-liches Epitop lokalisiert. Diese Region ist auch die Ursache für die Kreuzreaktivität von HaPV-VP1 mit anti-SV40- und anti-JCV-positiven Seren. Aufgrund der wichtigen Funktion der C-terminalen Region beim Virus-Assembly kann diese Region wahrscheinlich nicht als Insertionsort für Fremdsequenzen verwendet werden, während die Region As 84-87 für die Insertion von Fremdproteinsequenzen geeignet sein sollte. / Hamster polyomavirus (HaPV) particles were isolated and purified from the skin tumors of hamster polyomavirus infected hamsters. Virions were found to be approximately 45 nm in diameter. They demonstrate the typical icosahedral structure of polyomaviruses. However, in contrast to other polyomavirus capsids, they demonstrate a T=7-laevo symmetry. The analysis of the protein composition of the virus capsid showed that it is made up of mainly three virus-coded structural proteins VP1, VP2 and VP3. The VP1 represents up about 71% of the protein mass found in the virion and is therefore the major capsid protein. The prediction of the VP1-ORF showed the existence of 2 in-frame ATG codons which should result in the synthesis of VP1 proteins of 384 or 388 amino acids. The determination of the N-terminal amino acid sequence of the virion-derived VP1 by the method of Edman degradation revealed that the second ATG codon is the initiation site for translation. Therefore the authen-tic VP1 contains 384 amino acid residues (m.w. 41.8 kDa). The authentic VP1 and its N-terminal prolonged derivative were expressed in insect cells. The VP1 proteins reacted in the Western blot with HaPV-VP1-specific rabbit sera and sera of HaPV-infected hamsters. Both VP1 derivatives were able to form virus-like particles. In their density and morphology they are similar to empty HaPV virions. Electronmicroscopic inves-tigations and cell fractionation experiments demonstrated the nuclear localization of the parti-cles in insect cells. The treatment of particles with EGTA/DTT resulted in their dissociation in pentameric subunits. For use in gene therapy particles can be probably loaded with foreign nucleic acids by dissociation and subsequent reassociation. In order to find out potential insertion sites for foreign sequences in VP1, the three-dimen-sional structure of HaPV-VP1 was predicted on the basis of the known X-ray structure of re-lated polyomaviruses. In addition, epitopes within VP1 were mapped by means of truncated recombinant VP1 derivatives and synthetic peptides. According to structure modelling 5 sur-face-exposed regions exist in the HaPV-VP1: As 81-88, 222/223, 244-246, 289-294 and the C- terminal region. By epitope mapping we could show that at 2 out of these 5 regions in VP1, namely at As 79-97 and at the C-terminal part of HaPV-VP1, antigenic determinants are located. Most likely, in the C-terminal region (As 320-384) linear as well as at least one dis-continuous epitope exist. This region is also responsible for the cross-reactivity of HaPV-VP1 with anti-SV40 and anti-JCV-VP1-specific sera. Because of its important function in virus Assembly, the C-terminal part of HaPV-VP1 is not allowed to be used as insertion site for foreign sequences. According to the structural predictions and epitope mapping data the re-gion As 84-87 should allow the insertion of foreign protein segments.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/15157 |
| Date | 21 June 2000 |
| Creators | Siraj, Hassen |
| Contributors | Krüger, Detlev, Lucius, Richard, Scherneck, Siegfried |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | German |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf, application/octet-stream, application/octet-stream |
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